对于生物医学研究，在单细胞水平上了解异质性是非常重要的。基于质谱（MS）的蛋白质组学通过高灵敏度、高分辨率鉴定和定量数千种蛋白质，是一种用于单细胞分析的有前途的技术。但是，由于单细胞分离效率低，样品制备过程中样品损失大和通量低，因此实现单细胞蛋白质组学研究一直比较困难。
为应对这些挑战，在这里小编给大家介绍一篇单细胞蛋白质组学应用文集，作者将nanoPOTS（微流控芯片）技术与Thermo Scientific™ TMT™同位素标记定量技术相结合，使用带有实时搜索（Real-Time Search，RTS）功能的质谱仪Thermo Scientific™ Orbitrap Eclipse™ Tribrid™，提高单细胞蛋白质组覆盖率并提高定量准确性。
样品信息和方法
通过荧光激活细胞分选和nanoPOTS平台从培养的小鼠细胞中分离单个细胞。在nanoPOTS芯片上进行单细胞酶解和TMT 10Plex标记。使用Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000 RSLCnano液相系统，30µm i.d. × 30 cm C18色谱柱，20nL/min流速，串联Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，对5个单细胞批次（来自三种不同细胞类型（上皮、内皮和原始免疫细胞）的40个细胞）进行了具有RTS的MS2和SPS MS3分析。使用Thermo Scientific™ Proteome Discoverer™2.4软件进行数据分析，对Thermo Scientific™TMT定量进行了评估，对于蛋白质组学分析通量，蛋白质覆盖率和定量准确性也有一定的提高。
图1 nanoPOTS样品制备（点击查看大图）
基于nanoPOTS的单细胞蛋白质组学样品制备方法，包括胰蛋白酶酶解和TMT肽段标记，该方法的反应体系从常规的100µL降低至200nL，反应表面从127mm²降低至0.8mm²，降低损失的同时提高了酶解效率。
图2 SPS MS3和实时检索的SPSMS3方法综述（点击查看大图）
为了了解单细胞水平的细胞生物学，需要分析许多细胞，因此蛋白质组学需要一种为单细胞分析提供更高通量和多路复用能力的方法。基于MS2级的单细胞蛋白质组学是一种完善的工作流程。在这里，作者对Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪上的MS2和MS3级TMT单细胞多路复用LC-MS方法进行了评估，并优化了该方法以提高定量准确性而又不影响蛋白质覆盖率。
对三种培养的鼠类细胞群体（C10、SVEC和原始免疫细胞）进行TMT10plex分析，在40个单细胞中可鉴定2346个蛋白并定量到1300个蛋白。可以通过将nanoPOTS与Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪结合使用TMT来量化单细胞蛋白质组，从而使研究人员能够研究细胞异质性以及稀有细胞。
在三个nanoPOTS芯片上处理了共24个单细胞，并进行了三次LC-MS重复分析。TMT10plex数据的热图（左）和PCA图（中）分析表明，三种不同细胞类型（原始免疫细胞、上皮和内皮细胞）之间有明显的区别。TMT MS2方法共鉴定了1676个蛋白质和8234个肽段。
图3 使用MS2方法对鼠细胞进行分类（点击查看大图）
在两个nanoPOTS芯片上处理了共16个单细胞，并进行了两次LC-MS重复分析。TMT10plex数据的热图（左）和PCA分析（中）显示了三种不同细胞类型（原始免疫细胞、上皮和内皮细胞）之间的明显区别。通过Real-Time Search SPS MS3方法，总共鉴定了2346个蛋白质和4781个肽段（右），具有更高的定量准确性和蛋白质覆盖率。
图4 使用RTS SPS MS3方法对鼠细胞进行分类（点击查看大图）
实验结果
与基于MS2的TMT分析相比，使用带有实时搜索的SPS MS3方法时，两种不同细胞类型的TMT分析显示差异表达蛋白的覆盖率提高。
具有实时搜索方法的TMT SPS MS3提高了三种细胞类型之间差异表达蛋白的覆盖范围，并且在不会影响已鉴定蛋白的总数的前提下提高了定量准确性。
图5 使用TMT MS2和SPS MS3进行实时搜索的TMT10plex分析的火山图（点击查看大图）
nanoPOTS平台与TMT多路复用同位素标记定量相结合，提供了一种强大的，高通量的蛋白质组学制备方法，可用于处理极小的生物样品，如单细胞分型、对干细胞发育的了解、对孤立的临床标本（循环肿瘤细胞）的蛋白质组学研究以及组织异质性的蛋白质组成像等。
最新型的三合一质谱仪Orbitrap Eclipse™ 平台带来了多项创新，其中实时检索（Real-Time Search）通过在流程中加入实时数据库快速检索，确定哪些MS²谱图可得到鉴定，并决定是否进行MS³采集，可显著提高定量肽段数目和通量，并进一步提高SPS-MS³的定量准确性，为TMT技术带来更大的优势！
参考文献
1.Zhu Y., et. al. Angew. Chemie - Int. Ed. 57, 12370 (2018)
2.Budnik B., et. al. Genome Biol. 19, 161 (2018)
3.Brian K. E., et. al. J Proteome Res., 18, 1299 (2019)
Thermo Fisher Scientific
United States
