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技术专家
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前言


固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)技术在1990年由加拿大Waterloo 大学Pawliszyn教授的工作小组提出,Supelco公司在1993年面世了SPME的商品化装置。SPME是一种集采样、萃取、浓缩、进样于一体的简便、快捷、环保、无溶剂的绿色样品前处理技术,在2001年被美国化学会“Anal Chem”杂志评为1990~2000分析化学领域六个最伟大的创意之一。此后,SPME技术在环境、食品、药物分析和法医鉴定等领域都得到了广泛的应用。

 

固相微萃取有三种基本的萃取模式:直接萃取、顶空萃取和膜保护萃取。其中顶空-固相微萃取(Headspace-Solid Phase Microextraction, HS-SPME)是将萃取纤维暴露于样品上方的空气中(图1),能够有效避免不挥发性物质及大分子干扰物质对分析过程的干扰,尤其适用于复杂基质样品中的挥发性化合物分析。食品中挥发性香气化合物具有分子量小、挥发性大的特征,而食品基质又多为富含蛋白、脂肪、碳水化合物、色素等不挥发性大分子化合物的复杂体系,因此,HS-SPME是一种适合食品中香气物质分析的快捷、环保的方法。

 

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图1 顶空-固相微萃取萃取流程

(Step1:待测样品置于顶空瓶中;Step2:萃取纤维暴露于样品顶空之中;Step3:样品基质中的待测化合物被萃取纤维的涂层所吸附/吸收并浓缩;Step4:萃取纤维暴露于GC进样口进行热解吸)

 

传统的SPME萃取纤维(SPME Fiber),涂布了固定相的熔融石英纤维连接在萃取头内部的不锈钢丝上,外层是可以刺穿GC进样口隔垫的不锈钢针管,萃取纤维可在针管中伸缩。然而,SPME Fiber 有个明显的劣势:萃取纤维容易折断或不锈钢针管被外力挤压变形。此外,吸附型萃取头(DVB/PDMS、CAR/PDMS、DVB/CAR/PDMS)相对于吸收型萃取头(PDMS、PA、PEG),更容易发生竞争性吸附现象,因为其吸附剂的表面积有限,高浓度待测物或者与萃取纤维具有更强亲和力的待测物会取代体系中亲和力较低的化合物。近来,新技术SPME Arrow通过改善萃取头的形状、粗细、涂层体积等方式(图2),有效改善了SPME Fiber的这两个局限性。

 

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图2 SPME Arrow与传统SPME Fiber结构对比图


SPME方法中,提高萃取效率与样品搅拌密切相关。对于直接萃取的SPME而言,实际搅拌速率不能达到理想搅拌时,流体与纤维涂层之间会存在一定的边界层,边界层越厚,萃取到达平衡所需的时间越长。边界层厚度由样品对流/搅拌速率和分析物的扩散系数决定。而对于HS-SPME,良好的搅拌可以提高待测物从样品基质转移到顶空部分的传质速率。使用自动进样器的SPME方法,如何改善容量有限(10-20 mL)的样品瓶中样品的搅拌效果,是提高SPME萃取效率的关键。Thermo Scientic TriPlus RSH自动进样器上SPME Arrow Tool结合全新的Heatex Stirrer 样品震荡模块(图3),可有效提高样品震荡效率,以缩短SPME萃取达到平衡的时间。

 

通常使用HS-SPME结合GC-MS分析酒中挥发性香气物质的过程中,会将酒体以水稀释一定的倍数,来避免乙醇对其他香气化合物造成过度的竞争吸附影响。然而,较大的稀释比例又会造成酒中低浓度的关键香气化合物检测缺失,也对GC-MS的检测灵敏度提出了更高的要求。超高分辨静电场轨道阱气质联用仪(GC-Orbitrap/MS)无与伦比的灵敏度在食品香气物质分析的应用优势显著,在此前的应用文章中已得到证明。

 

因此,本文以GC-Orbitrap/MS分别结合SPME Arrow和SPMEFiber两种前处理方法,对比剖析黄酒中挥发性化合物组成,以期通过SPME Arrow新技术补偿传统SPME Fiber在风味物质分析中的短板,从而提供一套更加便、有效的食品中挥发性香气物质分析的工作流程。

 

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图3 Thermo ScienticTM TriPlus RSH 自动进样器上SPME Arrow工作流程


2、实验条件


2.1 样品:购于上海超市中某品牌黄酒(酒精度13%VOL)


2.2 仪器和方法设置


2.2.1 仪器
使用Thermo ScienticTM Q Exactive GC Orbitrap质谱仪,配备Thermo ScienticTM TriPlus RSH自动进样器及Thermo Scienti-cTM TRACE 1310 气相色谱仪进样样品分析。采用Thermo ScienticTM TraceGOLD TG-5SilMS (60 m × 0.25 mm × 0.25 μm)毛细管色谱柱实现色谱分离。


2.2.2 SPME Fiber方法
选用 50/35 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头;4 mL黄酒样品、1 mL去离子水及1.5 g氯化钠于20 mL顶空瓶中;55℃平衡10min,然后以55℃萃取20min,在进样口(250℃)解析3min;每个样品之间,萃取头于270℃老化10min,以防止样品间污染。


2.2.3 SPME Arrow 方法

选用DVB/Carbon WR/PDMS SPME Arrow萃取头;取4 mL黄酒样品、1 mL去离子水及1.5 g氯化钠于20 mL顶空瓶中;55℃平衡5min,然后以55℃萃取20min,在进样口(250℃)解析3min;孵化炉震荡速率:500 rpm,萃取炉震荡速率:1000rpm;每个样品之间,萃取头于270℃老化10min,以防止样品间污染。SPME Arrow条件优化过程中,固定待优化参数外的其他条件,逐步优化,以优化得到的最佳参数进行下一步实验。


2.2.4 气相色谱条件
进样口:SSL分流/不分流进样口,250℃;分流比:20:1;载气:He,1.0 mL/min;程序升温:40℃ 保持2min,以7℃ /min升到150℃ ,保持0.5min,然后以20℃升到250℃,保持7min;


2.2.5 Orbitrap质谱条件
分辨率选择:30,000 FWHM(200 m/z)
扫描范围:33-350 m/z,全扫描(Fullscan模式)
EI模式下离子源温度:280 ℃;电子能量:70eV


2.3 数据处理


使用Thermo ScienticTM TraceFinder(version 4.1)采集并处理数据。通过Tracender Deconvolution Plugin对数据进行解卷积处理,然后再将解卷积之后的高分辨质谱图与GC-Orbitrap/MS高分辨自建库和商业数据库(NIST、Wiley等)进行比对,采用高分辨过滤分值(HRF Score)、谱库比对的正向匹配度(SI
值)和保留指数(Retention Index, RI),共同确证未知化合物的定性结果。


3、结果与讨论


3.1 SPME Arrow萃取条件优化


顶空-固相微萃取(HS-SPME)是三相平衡的萃取过程,待测化合物在萃取头涂层/顶空的分配系数以及顶空/样品之间的分配系数,是影响整个萃取过程的关键。而这两个分配系数又与萃取相本身性质、体系的温度和压力、样品基质的pH值和盐度、待测物浓度等参数相关。由于黄酒体系基质复杂,待测香气化合物成分多样,因此本实验参考文献报道及实际样品化合物检出情况,选择包括醇、酯、醛、酮、酸、酚、呋喃、含
硫化合物、吡嗪在内的,具有代表性的香气化合物作为SPMEArrow条件筛选的参考物质,如下:乙醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醛、3-甲氧基-3-甲基-2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、乳酸乙酯、3-甲基丁酸、糠醛、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、苯乙醇、琥珀酸二乙酯、4-乙基苯酚、苯乙酸乙酯、3-乙酰基-2,5-二甲基噻吩、二氢-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、乙酸,以它们在不同萃取条件下的相对峰面积评价萃取效果。


3.1.1 萃取头的选择
选择合适的SPME涂层是建立SPME方法的第一步。SPMEArrow的可选涂层种类与现有商业化SPME Fiber的涂层类似,吸收型(液体涂层)萃取头包括PA、PDMS(100 μm,250μm),吸附型(固体涂层)包括DVB/PDMS、CAR/PDMS和DVB/CAR/PDMS。其中混合相涂层的三种萃取头都是双极性的吸附型萃取头,适合分析低浓度及极性范围大的复杂化合物,因此更适合于食品风味分析。本实验考察了CAR/PDMS、DVB/CAR/PDMS、DVB/PDMS、PA和PDMS(100 μm)五个SPME Arrow萃取头对黄酒香气物质的萃取效果,结果如表4所示。DVB/CAR/PDMS涂层的SPME Arrow萃取头对各类化合物的萃取效果都较好,因此选择该涂层萃取头进行下一步实验。

 

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图4 不同SPME Arrow萃取头萃取得到黄酒中代表性香气物质的相对峰面积


3.1.2 酒水比
一直以来,用HS-SPME Fiber分析酒类香气的实验方案都必须把样品体系内的乙醇浓度下降到5%以下,来尽可能避免乙醇在SPME Fiber涂层上因竞争性吸附作用而干扰其他化合物的分析结果。然而,对样品过度的稀释又会影响到低浓度化合物或水溶性强的化合物的检出效果。本实验采用酒水比,1:4、2:3、3:2、4:1、5:0五个比例的黄酒样品,分别用SPME Arrow对其进行萃取,结果如图5所示。加水后,乙酸乙酯、3-甲基丁醛、3-甲氧基-3-甲基-2-丁酮、3-甲基-1-丁醇、乳酸乙酯的相对峰面积大幅度下降。为了在降低乙醇影响的同时不过分稀释样品,后续实验选择4:1的酒水比进行。

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图5 不同酒水比对黄酒中代表性香气物质的相对峰面积的影响


3.1.3 其他萃取条件

此外,本实验就萃取温度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)、萃取时间(10min、15min、20min、25min、30min)、解析时间(1min、2min、3min、4min、5min)、氯化钠浓度(120g/L、180 g/L、240 g/L、300 g/L、360 g/L)也分别进行了优化,如图6所示。最终选取的最佳条件为,在样品中添加300 g/L的氯化钠,然后再55℃下萃取20min,最后在GC进样口解析3min。

 

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图6 其他萃取条件对黄酒中代表性香气物质的相对峰面积的影响


3.2 SPME Fiber 与SPME Arrow对比分析黄酒中挥发性香气物质


黄酒SPME-GC-Orbitrap/MS的数据通过Tracefinder高分辨解卷积插件( Deconvolution Plugin)进行准确定性分析。解卷积插件通过自定义的解卷积参数针对不同的样品数据,结合精确质量数偏差(Accurate Mass Tolerance)、高分辨质谱信噪比(m/z Signal to Noise Threshold)、碎片离子轮廓精确比对(Ion overlap)等参数,从而获得高匹配度的解卷积分析结果。针对批量样品,可进一步进行峰对齐分析,通过内置RTAlignment功能,以检索结果、保留时间窗口限定、相似度自检和本地排除等功能,可将解卷积结果进行基于高分辨质谱峰的对齐处理。同时,针对部分样品中阈值或仪器检出限以下的空白结果通过Gap filling功能自动填充,以适应不同的数据处理需求。


相同的解卷积条件下,SPME Fiber和SPME Arrow的样品分别定性出80和103个化合物,后续通过RT Alignment的Gap filling功能,对SPME Fiber样品中缺少的23个化合物进行了补充积分。两种SPME方法中共检测黄酒中挥发性化合物103种,其中醛类12种、酸类10种、酮类4种、酯类27种、醇类14种、酚类4种、呋喃类15种、吡嗪2种、含硫化合物5种、其他10种。SPMEArrow检出挥发性化合物的总峰面积是SPME Fiber的4.48倍,乙醇在SPME Fiber萃取所得总峰面积中占比高达63%,而在SPME Arrow中仅占38%。SPME Arrow更大的涂层容量给了黄酒中次高的乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯更大的释放空间,同时,其他化合物的占比也由24%增涨到34%。

 

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图7 SPME Arrow与SPME Fiber分析黄酒中挥发性香气物质相对峰面积对比图


SPME Arrow检测到所有挥发性化合物(103个)峰面积均大于SPME Fiber所测,其中33个化合物峰面积相差10倍以上(表1)。部分极易挥发的小分子醇类(正丙醇、2-丁醇、异丁醇、2-甲基-1-丁醇、2,3-丁二醇)、酸类(乙酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸)和酯类(乳酸乙酯)物质,峰面积提高11-422倍不等,其中,2,3-丁二醇的两个手性异构体峰面积提高了两百倍以上。降低了乙醇的影响后,这些极易挥发的化合物相比于其他化合物,更容易占据SPME Arrow萃取涂层中富余的空间,因此,峰面积响应提高明显。此外,一些半挥发性化合物,如香兰素、苯甲酸、苯丙酸乙酯、4-乙基愈创木酚等含苯环的醛、酸、酯、酚类化合物,以及呋喃类化合物,峰面积也有明显的增加,可能是由于在更大涂层容量的SPME Arrow体系下,这些相对难挥发的化合物在达到萃取平衡状态时,受到的竞争性吸附影响更小。

 

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表1 SPME Arrow与SPME Fiber分析黄酒中挥发性香气物质相对峰面积对比(部分化合物)

 

4、结论


(1)本实验针对黄酒挥发性风味物质分析,优化得到最佳的HS-SPME Arrow萃取条件:采用DVB/CAR/PDMS涂层的SPMEArrow萃取头,取4 mL黄酒及1 mL超纯水,加入300 g/L的氯化钠溶液,在55℃下萃取20 min,最后在GC进样口解析3min进样分析。


(2)HS-SPME Arrow相比传统的HS-SPME Fiber方法,能更充分地发挥高分辨静电场轨道阱气质联用仪(GC-Orbitrap/MS)高灵敏度的优势,相同软件条件下,准确定性得到的化合物数量提高1/4。

 

(3)相比于SPME Fiber方法,SPME Arrow能够减少SPME方法分析酒类时乙醇等化合物带来的的竞争性吸附影响,极易挥发的化合物和半挥发性化合物的响应都有了明显的提升。


(4)全文展示了一套SPME 方法的优化流程,并建立一套针对黄酒挥发性香气化合物分析的HS-SPME Arrow GC-Orbitrap/MS工作流程,以供后续相关研究参考。

 

参考文献
1. 欧阳钢锋, Janusz Pawliszyn.《固相微萃取原理与应用》(2012)
2. 《AN_19006气相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(GCOrbitrap/MS)分析烤肉中的挥发性香气成分》
3. 《AN_19008 基于HS-SPME-GC-MS结合多元统计分析方法鉴定四川浓香型菜籽油特征香气化合物》

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‎09-01-2022 09:00 AM
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