Real-Time Search实时检索助力Orbitrap Eclipse实现TMT 高通量精准定量

[技术专家]

关键词:
Orbitrap Eclipse， Real Time Search，FAIMS Pro， TMT标记定量，DIA定量分析

前言

TMT标记定量是蛋白质组学多重定量分析研究中使用最广泛、也是功能最强大的研究策略，有实验周期短、检测通量高、缺失值少等优点，目前TMT标记已经可以同时完成最多18个样品的定性定量。这项技术面临的主要挑战为，共隔离肽段的干扰和MS2谱图中共碎裂导致定量精度的折损。为了解决这一挑战，在Orbitrap Fusion和Orbitrap Fusion Lumos “三合一”系列质谱SPS-MS3方法的基础上，赛默飞基于2019年新推出的Orbitrap Eclipse质谱，开发了一种称为RTS-SPS-MS3（RTS，Real Time Search，实时检索）[1]的新技术。

本文中，我们借助Thermo Scientific™ Pierce™ TMT11plex yeast酶解肽段标准品、掺入6种蛋白质消化物的TMT10plex标记的细胞或血浆样品、酵母和去高丰度血浆混合样品，评估了Orbitrap Eclipse质谱仪特有的RTS-SPS-MS3 TMT定量方法的通量和定量准确度。

试验方法

1. 样品前处理

1.1 样品1：TMT11plex-yeast标准品[2]

Thermo Scientific™ Pierce™ TMT11plex-yeast（以下简称TKO）酶解标准品在室温下放置20min，用0.1% FA溶解成100 ng/μl，用于优化方法和评估RTS-SPS-MS3定量分析的通量及准确度。

1.2 样品2：掺入6种蛋白消化物的TMT10plex标记的细胞或去高丰度血浆肽段

293T细胞及Top 14去高丰度血浆样品，分别抽提蛋白质、还原烷基化后用FASP方法Trypsin酶切。如图1，酶解样品中按比例加入一定量的6种蛋白酶切肽段，留出10μg用于后续DIA分析。剩余肽段分别用TMT10plex试剂标记并混合，一部分用于single phase MS2、SPSMS3及RTS-SPS-MS3分析；另一部分通过高pH反相色谱分成72馏分，合并为24个组分后用于深度RTS-SPS-MS3分析。

图1.混有6种蛋白消化物的TMT标记的293T/plasma样品处理流程示意图

1.3 样品3：酵母和去高丰度血浆混合样品

以相同量的Top 14去高丰度血浆为背景，按一定比例掺入酵母酶切肽段。将酵母和血浆混合样品用TMT10plex试剂标记，取等量标记好的肽段混合、脱盐并用Orbitrap Eclipse质谱进行4h 1D-LC-MS/MS检测。

2. 色谱方法（或其他）

高效液相色谱：Thermo Scientific Easy-nLC 1200，Ultimate 3000RSLCnano；
色谱柱：Acclaim™ PepMap™ Column (164941，C18, 2 μm, 100Å ,75 μm x 25 cm)；
流动相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid in 80%Acetonitrile；
色谱梯度：60min （TKO样品）、120min （293T样品）、90min（plasma样品）

表1. 液相梯度示例 （90min）

3. 质谱条件

3.1 TMT样品的质谱采集参数

MS2、SPS-MS3及RTS-SPS-MS3的主要参数如表2所示，其中Real Time Search相关参数Xcorr值设置为1，ΔCn设置为0.1，Precursor PPM设置为10。

表2. MS2、SPS-MS3 及RTS-SPS-MS3的质谱参数设置

3.2 DIA样品的质谱采集参数（以90min梯度为例）

MS1：分辨率：60,000@m/z 200，扫描范围：350-1200，AGC: standard， Max IT：20ms；
DIA：50 window，分辨率：30,000@m/z 200，AGC: 1000%，Max
IT：54ms，HCD collision energy：32，扫描范围200-2000，Loop
control：All。

4. 数据处理

TMT数据均使用Proteome Discoverer 2.4软件进行分析，MS1质量偏差为10ppm，MS2质量偏差为0.02Da（MS2方法）或0.6Da（MS3方法），将TMT6plex（229.163 Da）设置为固定修饰，FDR设置为0.01。

实验结果和讨论

1. 实时检索提高 SPS-MS3 定量蛋白质组的覆盖深度

为评估实时检索对TMT标记定量方法通量的提升效果，此处分别使用 MS2、SPS-MS3 和 RTS-SPS-MS3 方法分析 500ng TKO酶解肽段，评估实时检索在肽段和蛋白水平的定量提升效果。如图2A和2B所示，60 分钟梯度，RTS-SPS-MS3可以鉴定和定量到的蛋白和肽段数目及比例接近于MS2方法，比传统的SPS-MS3 方法有明显提升。

图2. MS2、SPS-MS3 及RTS-SPS-MS3方法的肽段和蛋白鉴定和定量结果

2. 实时检索智能采集策略提高 TMT 定量准确度

实时检索使用Comet搜索引擎[3]，可以实时智能地确定选择哪些碎片实施三级碎裂，从而降低共流出肽段的干扰以提高结果的定量准确度。首先，在TKO标准品的RTS-SPS-MS3定量测试结果中，接近84%的肽段的SPS mass match匹配值>70%(图3B)，与未使用RTS的SPS MS3(图3A)相比有显著提升。同时，Pierce TKO标准品包含三个蛋白敲除菌株（Met6Δ、His4Δ 和 Ura2Δ，图3C），可通过计算无干扰指数 (IFI)[2]评估定量准确度。如图3D所示，与 MS2定量相比，RTS-SPS-MS3干扰可降低 20%，提高定量准确性。

3. 评估 TMT 定量准确度并与 DIA 方法进行比较

TMT标记定量是蛋白质组深度表征的利器，为此我们使用分级的TMT-10plex标记的293T细胞和去高丰度血浆样本进行了RTS-SPSMS3测试，总分析时间分别为 24 小时和 18 小时。我们从TMT 标记的 293T 分级样品（24个组分，每个组分500 ng）中鉴定到9728个蛋白和超过 80000 个肽段，从TOP14 去高丰度血浆分级样品（24个组分，每个组分500 ng）中鉴定到 1411 个蛋白和 10000 个肽段（表3）。

同时，借助 DIA 法检测对应293T 和TOP14 去高丰度血浆样品 未标记的肽段（分别10个样品，每个样品 1 μg），其中 DIA的总分析时间近似于TMT分析时间。在相同的分析持续时间下，TMT 定量的蛋白质组覆盖率大于 DIA方法。

 图3. 实时检索提升TKO标准品的TMT定量准确度。SPS-MS3和RTS-SPS-MS3两种方法中SPS mass match得分的分布图（图A, B）； 不同定量方法下，His4、 Met6
和 Ura2三种蛋白的IFI值（图C, D）。

表 3. 使用TMT及DIA方法对 293T 细胞或去高丰度血浆解析到的蛋白数目

另外，分析以特定比例掺入到293T 细胞或血浆肽段背景中的6 种蛋白酶解产物[4]，如图4所示， RTS-SPS-MS3可提升深度研究阶段的定量准确度，但与RTS-SPS-MS3 法相比， DIA能提供更加准确地定量结果。

图4. 293T 细胞或血浆肽段背景中掺入种酶解产物的TMT及DIA方法的实测比值

4. FAIMS Pro助力RTS-SPS-MS3，实现TMT快速精准定量

此外，考虑到FAIMS Pro技术通过调节FAIMS CV（补偿电压）值，分离带电性质不同的肽段，简化样品复杂程度，可减少肽段共隔离从而提高定性定量效率及准确度，我们也进行了相应的测试。如图5所示，借助酵母和去高丰度血浆混合样品进行4h分析，FAIMS Pro与Real Time Search双剑合璧，可以明显提升蛋白和肽段的鉴定数量（图5A、5B）；并且定量结果更加准确，测得的定量比值更接近于预期值（图5C）。

图5. FAIMS Pro提升RTS-SPS-MS3的定量通量(图A, B)及定量准确度(图C)

结论

Orbitrap Eclipse 仪器特有的 RTS-SPS-MS3方法是目前兼具定量通量和定量准确度的新方案。在这里，我们使用了一系列的复杂模型，包括 Pierce™ TMT11plex 酵母酶解肽段标准品、 掺入6种蛋白消化物的TMT10plex标记的细胞或去高丰度血浆肽段、以及TMT10plex标记的酵母和去高丰度血浆混合样品，评估了Orbitrap Eclipse质谱Real Time Search及FAIMS Pro功能对TMT定量的鉴定和定量性能的提升效果。从中可知，基于RTS-SPS-MS3的TMT定量方法既可以有效提升研究的通量，即鉴定和定量的蛋白肽段数目，也可以有效改善TMT定量中由于共隔离导致的定量准确性问题。此外，DIA定量方法可用于进一步验证高通量TMT的研究结果。借助这些新技术能够获得更加可靠的数据，并最终将其转化为有意义的生物学成果。

参考文献
1. Erickson, B.K., et al., Active instrument engagement combined with a real-time database search for improved performance of sample multiplexing workflows. J Proteome Res., 2019. 18(3): p. 1299-1306
2. Paulo, J.A ., et al, A triple knockout (TKO) proteomics standard for diagnosing ion interference in isobaric labeling experiments. J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2016. 27(10): p. 1620-1625.
3. Eng, J.K., et al, Comet: an open source tandem mass spectrometry sequence database search tool. Proteomics. 2013. 13(1), 22–24.
4. Jan Muntel, et al, Comparison of Protein Quantification in a Complex Background by DIA and TMT Workflows with Fixed Instrument Time. J. Proteome Res. 2019, 18, 3, 1340–1351.

仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。

@dongdan