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技术专家
Team TFS
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关键词:
Orbitrap Fusion Lumos,Easy-nLC 1200,Label free定量/TMT标记定量,快速深度分析

 

1.前言


近年来,生物质谱技术不断创新,仪器性能也不断完善;从单一质量分析器质谱到双质量分析器的串联质谱,再到2013年赛默飞推出世界上第一款“三合一”质谱Orbitrap Fusion。Orbitrap Fusion集结了四级杆的高选择性和宽动态范围,静电场轨道阱的超高分辨率和超高质量精度,以及线性离子阱的多级质谱分析性能,可以满足从定性到定量,再到结构解析等所有工作需求。目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖,并革新性地完成了“一小时酵母蛋白质组”的鉴定。

 

Label free定量和TMT标记定量是目前运用最广泛的两种蛋白质组学研究手段,拥有一个更高效的解析平台尤为重要。在本篇工作中,我们采用Orbitrap Fusion Lumos超高分辨质谱,对源自细胞的肽段以及TMT标记后的组分,进行了1h或2h的快速分析,对其蛋白质组进行定性定量研究。


2. 实验方法


2.1 样品信息


对人源293T细胞、KG1a 细胞,分别抽提蛋白质、FASP酶切。其中,KG1a肽段用TMT6plex试剂标记。标记完成后,将各个标记的样本混匀,使用pH10-RP梯度分级,共得10个组分。Hela标准品、自制的293T肽段和TMT标记的KG1a肽段,使用A液(0.1% FA,H2O)复溶, Orbitrap Fusion Lumos对样本进行定性定量分析。


2.2 高效液相色谱条件


高效液相色谱:Thermo Scientific Easy-nLC 1200;

色谱柱:Acclaim™ PepMap™ Column (C18, 2 μm, 100 Å ,75μm x 25 cm);
流动相:A: 0.1% Formic acid in water; B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile;
LFQ色谱梯度:60min、140min;TMT:60min
流速:300 nL/min e.g. 60min-gradient:

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2.3 质谱条件


2.3.1 Label Free样品的质谱采集参数
质谱仪:Orbitrap Fusion Lumos
通用设置:喷雾电压:2.2kV;毛细管温度:320℃;Funnel RF:40% ;碰撞能量:28% HCD; Injection ions for all available parallelizable time:True;Single charge state per precursor only:True;母离子扫描范围:m/z 350-1500;数据
采集模式:Top Speed;Cycle time:3s;Dynamic exclusion time:60s

OT-HCD-OT参数: APD:True;MS1:分辨率:60,000@m/z200,Max IT:20ms;MS2:分辨率:15,000@m/z 200,扫描范围:start from m/z 120,AGC: 5e4,Max IT:60ms,Isolation
window:1.6Da.
OT-HCD-IT参数: APD:True;MS1:分辨率:120,000@m/z200,Max IT:50ms;MS2:(Ion Trap) Rapid,扫描范围:start from m/z 120,AGC: 1e4, Max IT:25ms,Isolation window:1.6Da.


2.3.2 TMT样品质谱采集参数
MS2定量参数: APD:False;MS1:分辨率:60,000@m/z200,Intensity threshold:4e5;MS2:分辨率:15,000@m/z200,扫描范围:start from m/z 100,Dynamic exclusion time:40s,AGC: 5e4,Max IT:30ms,Isolation window:1.2Da,碰撞能量:35% HCD.
SPS-MS3定量参数: APD:False;MS1:分辨率50,000@m/z200,Intensity threshold:5e3;MS2:scan type:Ion Trap, Rapid,Dynamic exclusion time:60s,AGC: 1e4,Activation type: CID,Max IT:full MS/MS 30ms;MS3:SPS 5,Activation type: HCD,HCD碎裂能量:65,MS3分辨率:30000,扫描范围100-500,Max IT:50ms.

 

2.4 数据分析


原始文件(raw file)使用 Proteome Discoverer 2.2 软件搜索Swissprot_Human.fasta 数据库,检索结果通过严格标准进行筛选(PSM FDR < 1%, peptide FDR < 1%)。


3. 实验结果


Easy-nLC 1200超高效液相采用NanoViper接头,死体积小。最大耐压提升至1200bar,具备良好的色谱重现性和分离分析性能。如图1所示,两天内的多次检测之间具有很好的重现性。Orbitrap Fusion Lumos质谱使用高容量离子传输管(HCTT)和电动离子漏斗(EDIF),具备更高的灵敏度;三段式的四级杆,提升离子的选择和传输效率。如图2所示,60min和140min最高分别可以鉴定到4700个和5900个293T蛋白质,以及30000和58000个肽段,体现了Orbitrap Fusion Lumos-EasynLC1200分析平台的优异性能。Lumos同时拥有超高分辨的Orbitrap(OT)检测器和扫描速度更快的离子阱(IT)检测器。如图3所示,两种模式在140min内鉴定的蛋白重合度为82%;组合使用,肽段数目可以提升20~40%。

 

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图1. LC-MS的重现性

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图2. Orbitrap Fusion Lumos 在60min和140min内的鉴定数目

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图3. HCD-OT和HCD-IT鉴定的重叠度

 

将TMT6plex标记的KG1a肽段进行1:1混合,用pH10-RP UPLC梯度分成10个组分,Orbitrap Fusion Lumos对个组分进行1hMS2定量、1h-SPS-MS3和2h-SPS-MS3定量。定性和定量结果分别如表1和图4所示,SPS-MS3定量方式能够均衡通量与准确性,实现蛋白组的深度解析。

 

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表1. TMT6plex KG1a样品的鉴定结果

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图4. TMT6plex KG1a样品中肽段的定量结果

 

4. 结论


综上所述,第二代“三合一”质谱——Orbitrap Fusion Lumos通过诸多技术革新和性能深度优化,除解决复杂糖肽结构解析、完整蛋白Top-Down 分析等最具挑战的疑难问题外,也能够很好地进行复杂样品中的低丰度蛋白/化合物定性定量,更为高效地进行蛋白质组学深度测定,并应用于大规模临床样本等的高强度检测。

 

仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。

@dongdan 

 

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Last update:
‎09-15-2022 09:00 AM
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