关键词：
Orbitrap Fusion Lumos，Easy-nLC 1200，Label free定量/TMT标记定量，快速深度分析
1.前言
近年来，生物质谱技术不断创新，仪器性能也不断完善；从单一质量分析器质谱到双质量分析器的串联质谱，再到2013年赛默飞推出世界上第一款“三合一”质谱Orbitrap Fusion。Orbitrap Fusion集结了四级杆的高选择性和宽动态范围，静电场轨道阱的超高分辨率和超高质量精度，以及线性离子阱的多级质谱分析性能，可以满足从定性到定量，再到结构解析等所有工作需求。目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖，并革新性地完成了“一小时酵母蛋白质组”的鉴定。
Label free定量和TMT标记定量是目前运用最广泛的两种蛋白质组学研究手段，拥有一个更高效的解析平台尤为重要。在本篇工作中，我们采用Orbitrap Fusion Lumos超高分辨质谱，对源自细胞的肽段以及TMT标记后的组分，进行了1h或2h的快速分析，对其蛋白质组进行定性定量研究。
2. 实验方法
2.1 样品信息
对人源293T细胞、KG1a 细胞，分别抽提蛋白质、FASP酶切。其中，KG1a肽段用TMT6plex试剂标记。标记完成后，将各个标记的样本混匀，使用pH10-RP梯度分级，共得10个组分。Hela标准品、自制的293T肽段和TMT标记的KG1a肽段，使用A液（0.1% FA，H2O）复溶， Orbitrap Fusion Lumos对样本进行定性定量分析。
2.2 高效液相色谱条件
高效液相色谱：Thermo Scientific Easy-nLC 1200；
色谱柱：Acclaim™ PepMap™ Column (C18, 2 μm, 100 Å ,75μm x 25 cm)；
流动相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile；
LFQ色谱梯度：60min、140min；TMT：60min
流速：300 nL/min e.g. 60min-gradient：
2.3 质谱条件
2.3.1 Label Free样品的质谱采集参数
质谱仪：Orbitrap Fusion Lumos
通用设置：喷雾电压：2.2kV；毛细管温度：320℃；Funnel RF：40% ；碰撞能量：28% HCD； Injection ions for all available parallelizable time：True；Single charge state per precursor only：True；母离子扫描范围：m/z 350-1500；数据
采集模式：Top Speed；Cycle time：3s；Dynamic exclusion time：60s
OT-HCD-OT参数: APD：True；MS1：分辨率：60,000@m/z200，Max IT：20ms；MS2：分辨率：15,000@m/z 200，扫描范围：start from m/z 120，AGC: 5e4，Max IT：60ms，Isolation
window：1.6Da.
OT-HCD-IT参数: APD：True；MS1：分辨率：120,000@m/z200，Max IT：50ms；MS2：(Ion Trap) Rapid，扫描范围：start from m/z 120，AGC: 1e4， Max IT：25ms，Isolation window：1.6Da.
2.3.2 TMT样品质谱采集参数
MS2定量参数: APD：False；MS1：分辨率：60,000@m/z200，Intensity threshold:4e5；MS2：分辨率：15,000@m/z200，扫描范围：start from m/z 100，Dynamic exclusion time：40s，AGC: 5e4，Max IT：30ms，Isolation window：1.2Da，碰撞能量：35% HCD.
SPS-MS3定量参数: APD：False；MS1：分辨率50,000@m/z200，Intensity threshold：5e3；MS2：scan type：Ion Trap, Rapid，Dynamic exclusion time：60s，AGC: 1e4，Activation type: CID，Max IT：full MS/MS 30ms；MS3：SPS 5，Activation type: HCD，HCD碎裂能量：65，MS3分辨率：30000，扫描范围100-500，Max IT：50ms.
2.4 数据分析
原始文件（raw file）使用 Proteome Discoverer 2.2 软件搜索Swissprot_Human.fasta 数据库，检索结果通过严格标准进行筛选（PSM FDR < 1%, peptide FDR < 1%）。
3. 实验结果
Easy-nLC 1200超高效液相采用NanoViper接头，死体积小。最大耐压提升至1200bar，具备良好的色谱重现性和分离分析性能。如图1所示，两天内的多次检测之间具有很好的重现性。Orbitrap Fusion Lumos质谱使用高容量离子传输管（HCTT）和电动离子漏斗（EDIF），具备更高的灵敏度；三段式的四级杆，提升离子的选择和传输效率。如图2所示，60min和140min最高分别可以鉴定到4700个和5900个293T蛋白质，以及30000和58000个肽段，体现了Orbitrap Fusion Lumos-EasynLC1200分析平台的优异性能。Lumos同时拥有超高分辨的Orbitrap（OT）检测器和扫描速度更快的离子阱（IT）检测器。如图3所示，两种模式在140min内鉴定的蛋白重合度为82%；组合使用，肽段数目可以提升20~40%。
图1. LC-MS的重现性
图2. Orbitrap Fusion Lumos 在60min和140min内的鉴定数目
图3. HCD-OT和HCD-IT鉴定的重叠度
将TMT6plex标记的KG1a肽段进行1:1混合，用pH10-RP UPLC梯度分成10个组分，Orbitrap Fusion Lumos对个组分进行1hMS2定量、1h-SPS-MS3和2h-SPS-MS3定量。定性和定量结果分别如表1和图4所示，SPS-MS3定量方式能够均衡通量与准确性，实现蛋白组的深度解析。
表1. TMT6plex KG1a样品的鉴定结果
图4. TMT6plex KG1a样品中肽段的定量结果
4. 结论
综上所述，第二代“三合一”质谱——Orbitrap Fusion Lumos通过诸多技术革新和性能深度优化，除解决复杂糖肽结构解析、完整蛋白Top-Down 分析等最具挑战的疑难问题外，也能够很好地进行复杂样品中的低丰度蛋白/化合物定性定量，更为高效地进行蛋白质组学深度测定，并应用于大规模临床样本等的高强度检测。
仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。
Thermo Fisher Scientific
United States
