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技术专家
Team TFS
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关键词:
Orbitrap Exploris 480,FAIMS Pro,DIA,定量蛋白质组学

 

前言

 

数据非依赖性采集(Data-Independent Acquisition,DIA)是当前蛋白质组学中应用范围较广的定量方式。DIA扫描模式中,超高分辨质谱将一级质谱的质荷比范围分为若干窗口,快速地对特定质量范围内所有母离子进行碎裂并采集碎片离子。相比于传统的DDA方法,DIA定量有更好的重现性及准确性,DIA也更加适用于大队列定量蛋白质组学研究[1]。


作为应用于大队列的定量蛋白质组学研究策略,拥有一个更高效更稳定的解析平台尤为重要。Orbitrap Exploris系列质谱是赛默飞世尔科技公司从 2019 年推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪平台,采用全新的设计,让仪器具有更佳的性能和更高的稳定性,并且能够兼容FAIMS Pro接口,进一步提高检测灵敏度和抗污染能力。本文使用 Orbitrap Exploris 480质谱,对Hela细胞蛋白质组和血浆蛋白质组进行DIA及FAIMS-DIA定量分析,考察 Orbitrap Exploris 480的DIA定量能力。

实验方法


1. 实验材料和方法


Hela细胞、Top 14去高丰度血浆样品,分别抽提蛋白质、还原烷基化后用FASP方法进行Trypsin酶切,以不同梯度的DIA模式平行采集三针技术重复。


2. 色谱方法


高效液相色谱:Ultimate 3000 RSLCnano;
色谱柱:Acclaim™ PepMap™ Column (C18, 2 μm, 100 Å ,75 μmx 25 cm);
流动相:A: 0.1% Formic acid in water; B: 0.1% Formic acid in 80%
Acetonitrile;
有效色谱梯度时长:5min、15min、30min和50min。


表1. 液相梯度示例(50min有效梯度)

1.jpg

 

3. 质谱分析


DIA模式
质谱仪:Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480;
喷雾电压: 2.1kV;
毛细管温度:320 ℃;
RF lens: 50% ;
分辨率:一级60,000@m/z 200,二级30,000@m/z 200;
Max IT:Full MS 20ms,MS/MS 54ms;
AGC:Full MS 300%,MS/MS 2000%;
母离子扫描范围m/z 350-1200,子离子扫描范围 m/z 200-2000;
HCD collision energy:32;
窗口数目:20 (5min)、30 (15min)、40 (30min)、60 (50min);
Loop control:All。


FAIMS-DIA模式
质谱仪:Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480;FAIMS CV=-45V;
其他质谱参数与DIA采集模式相同。

 

DIA数据采用SpectronautTM 15软件进行Library-based分析:1).建立谱图库:Proteome Discoverer数据检索生成的pd.result文件导入 Spectronaut 建立谱图库,每个肽段最少含有 3 个碎片离子,最多含有 6 个碎片离子 (其中细胞谱图库中包含 11221 个蛋白,血浆谱图库中包含 5117 个蛋白);2). DIA数据峰抽提:导入DIA数
据,设定谱图库,控制 q<0.01;基于MS2峰面积进行定量。

 

FAIMS-DIA 数据采用 SpectronautTM 15软件进行Library-free DIA分析 :导入DIA 数据进行峰抽提,控制 PSM、肽段及蛋白的q<0.01,抽提的碎片离子最小长度≥3,每个肽段最少含有 3 个碎片离子,最多含有 6个碎片离子;基于MS2峰面积进行定量。


实验结果和讨论


1. DIA 定量分析


首先,经过优化 DIA 采集参数,结合 Spectronaut的library-based检索方式,如图1所示,三次DIA实验具有较好的重现性,50min的有效梯度内分别可以从500ng Hela 和去高丰度血浆酶解样品中检测到接近 6000 个和 760 个血浆蛋白。同时,Orbitrap Exploris 480超高分辨质谱凭借其优越的分析性能,在血浆样品结果展示中丰度最低和丰度最高的蛋白相差 5 个数量级,显示了 Orbitrap 具有较宽的动态范围(图1E)。

 

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图1. 采用Library-based DIA分析方式,Hela细胞及血浆的蛋白(A, C)和肽段鉴定数目(B, D);

血浆中定量蛋白的动态范围(E)

 

接下来,我们在 Orbitrap Exploris 480 上对FAIMS-DIA 参数进行了优化,包括分析时长、FAIMS CV 电压值、DIA窗口数目等,结果显示60min总梯度(50min有效梯度)内,单个FAIMS CV电压的结果较佳。如图2,上样500ng Hela 肽段,采用DIA和FAIMS-DIA方法结合Library-free 数据分析方式,可分别在50分钟有效梯度内定量超过5500个和6100个蛋白。

 

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图2. 采用Library-free DIA分析方式,

Hela细胞及血浆样品的DIA和FAIMS-DIA方法蛋白鉴定量分别为图A(Hela细胞)和图B(血浆)


在精准医学和大队列组学背景下,研究人员往往需要对大量样本实现快速高效检测[2],在这里我们以Orbitrap Exploris 480配合5min (80SPD)、15min (52 SPD)和30min (34 SPD) 短梯度进行高通量蛋白组学分析,结果如表2所示。从中可知,上样500ng Hela细胞肽段,配合15分钟短梯度及单电压FAIMS-DIA方法和Library-free检索方式,可定量超过4650个Hela蛋白和550个血浆蛋白,实现快速蛋白组学分析。其中,CV小于20%的蛋白占97.5%,CV小于20%的肽段占96.3%,medium CV 分别为3.4%(蛋白)和4.9%(肽段)。

 

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表2. 采用Library-free DIA分析方式,

Hela细胞及血浆样品在不同梯度中的蛋白和肽段鉴定数目,以及对应的CV值


结论


相较于传统的 DDA 定量方式,DIA方法具有重现性好、定量准确性高、受干扰小等优点,也越来越广泛地被运用于大队列分析。而DIA分析通常采取 1D LC-MS/MS 的分析方法,想获得深度的定量分析结果是非常有挑战的。因此,一个稳定、高效的DIA解决方案对于大队列及临床研究是必不可少的。


本文基于最新的 Orbitrap Exploris 480质谱平台,以 Hela细胞肽段和去高丰度血浆样品为模型考察 DIA及FAIMS-DIA的定量蛋白的能力。使用 50min 的有效梯度及Spectronaut软件无谱图库检索方法,FAIMS-DIA 方法就能定量到6100个蛋白、 35000条肽段,并且仪器稳定性高,动态范围宽,显示了Orbitrap 质谱出色的DIA定量能力。并且通过短梯度高通量的测试,15分钟短梯度即可定量超过4650个Hela蛋白,满足大规模临床样本等研究的高强度检测需求。

 

参考文献
1. Bruderer, R., et al, Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics 2015, 14, (5), 1400-10.
2. Dorte B. Bekker-Jensen , et al., A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Interface Improves Proteome Coverage in Short LC Gradients. Molecular & Cellular Proteomics, 2020, 19, 716–729.

 

仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。

@dongdan 

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Last update:
‎09-11-2022 10:00 AM
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