关键词：
Orbitrap Exploris 480，FAIMS Pro，DIA，定量蛋白质组学
前言
数据非依赖性采集（Data-Independent Acquisition，DIA）是当前蛋白质组学中应用范围较广的定量方式。DIA扫描模式中，超高分辨质谱将一级质谱的质荷比范围分为若干窗口，快速地对特定质量范围内所有母离子进行碎裂并采集碎片离子。相比于传统的DDA方法，DIA定量有更好的重现性及准确性，DIA也更加适用于大队列定量蛋白质组学研究[1]。
作为应用于大队列的定量蛋白质组学研究策略，拥有一个更高效更稳定的解析平台尤为重要。Orbitrap Exploris系列质谱是赛默飞世尔科技公司从 2019 年推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪平台，采用全新的设计，让仪器具有更佳的性能和更高的稳定性，并且能够兼容FAIMS Pro接口，进一步提高检测灵敏度和抗污染能力。本文使用 Orbitrap Exploris 480质谱，对Hela细胞蛋白质组和血浆蛋白质组进行DIA及FAIMS-DIA定量分析，考察 Orbitrap Exploris 480的DIA定量能力。
实验方法
1. 实验材料和方法
Hela细胞、Top 14去高丰度血浆样品，分别抽提蛋白质、还原烷基化后用FASP方法进行Trypsin酶切，以不同梯度的DIA模式平行采集三针技术重复。
2. 色谱方法
高效液相色谱：Ultimate 3000 RSLCnano；
色谱柱：Acclaim™ PepMap™ Column (C18, 2 μm, 100 Å ,75 μmx 25 cm)；
流动相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid in 80%
Acetonitrile；
有效色谱梯度时长：5min、15min、30min和50min。
表1. 液相梯度示例（50min有效梯度）
3. 质谱分析
DIA模式
质谱仪：Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480；
喷雾电压： 2.1kV；
毛细管温度：320 ℃；
RF lens： 50% ；
分辨率：一级60,000@m/z 200，二级30,000@m/z 200；
Max IT：Full MS 20ms，MS/MS 54ms；
AGC：Full MS 300%，MS/MS 2000%；
母离子扫描范围m/z 350-1200，子离子扫描范围 m/z 200-2000；
HCD collision energy：32；
窗口数目：20 (5min)、30 (15min)、40 (30min)、60 (50min)；
Loop control：All。
FAIMS-DIA模式
质谱仪：Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480；FAIMS CV=-45V；
其他质谱参数与DIA采集模式相同。
DIA数据采用SpectronautTM 15软件进行Library-based分析：1).建立谱图库：Proteome Discoverer数据检索生成的pd.result文件导入 Spectronaut 建立谱图库，每个肽段最少含有 3 个碎片离子，最多含有 6 个碎片离子 （其中细胞谱图库中包含 11221 个蛋白，血浆谱图库中包含 5117 个蛋白）；2). DIA数据峰抽提：导入DIA数
据，设定谱图库，控制 q<0.01；基于MS2峰面积进行定量。
FAIMS-DIA 数据采用 SpectronautTM 15软件进行Library-free DIA分析 ：导入DIA 数据进行峰抽提，控制 PSM、肽段及蛋白的q<0.01，抽提的碎片离子最小长度≥3，每个肽段最少含有 3 个碎片离子，最多含有 6个碎片离子；基于MS2峰面积进行定量。
实验结果和讨论
1. DIA 定量分析
首先，经过优化 DIA 采集参数，结合 Spectronaut的library-based检索方式，如图1所示，三次DIA实验具有较好的重现性，50min的有效梯度内分别可以从500ng Hela 和去高丰度血浆酶解样品中检测到接近 6000 个和 760 个血浆蛋白。同时，Orbitrap Exploris 480超高分辨质谱凭借其优越的分析性能，在血浆样品结果展示中丰度最低和丰度最高的蛋白相差 5 个数量级，显示了 Orbitrap 具有较宽的动态范围（图1E）。
图1. 采用Library-based DIA分析方式，Hela细胞及血浆的蛋白（A, C）和肽段鉴定数目（B, D）；
血浆中定量蛋白的动态范围（E）
接下来，我们在 Orbitrap Exploris 480 上对FAIMS-DIA 参数进行了优化，包括分析时长、FAIMS CV 电压值、DIA窗口数目等，结果显示60min总梯度（50min有效梯度）内，单个FAIMS CV电压的结果较佳。如图2，上样500ng Hela 肽段，采用DIA和FAIMS-DIA方法结合Library-free 数据分析方式，可分别在50分钟有效梯度内定量超过5500个和6100个蛋白。
图2. 采用Library-free DIA分析方式，
Hela细胞及血浆样品的DIA和FAIMS-DIA方法蛋白鉴定量分别为图A（Hela细胞）和图B（血浆）
在精准医学和大队列组学背景下，研究人员往往需要对大量样本实现快速高效检测[2]，在这里我们以Orbitrap Exploris 480配合5min (80SPD)、15min (52 SPD)和30min (34 SPD) 短梯度进行高通量蛋白组学分析，结果如表2所示。从中可知，上样500ng Hela细胞肽段，配合15分钟短梯度及单电压FAIMS-DIA方法和Library-free检索方式，可定量超过4650个Hela蛋白和550个血浆蛋白，实现快速蛋白组学分析。其中，CV小于20%的蛋白占97.5%，CV小于20%的肽段占96.3%，medium CV 分别为3.4%（蛋白）和4.9%（肽段）。
表2. 采用Library-free DIA分析方式，
Hela细胞及血浆样品在不同梯度中的蛋白和肽段鉴定数目，以及对应的CV值
结论
相较于传统的 DDA 定量方式，DIA方法具有重现性好、定量准确性高、受干扰小等优点，也越来越广泛地被运用于大队列分析。而DIA分析通常采取 1D LC-MS/MS 的分析方法，想获得深度的定量分析结果是非常有挑战的。因此，一个稳定、高效的DIA解决方案对于大队列及临床研究是必不可少的。
本文基于最新的 Orbitrap Exploris 480质谱平台，以 Hela细胞肽段和去高丰度血浆样品为模型考察 DIA及FAIMS-DIA的定量蛋白的能力。使用 50min 的有效梯度及Spectronaut软件无谱图库检索方法，FAIMS-DIA 方法就能定量到6100个蛋白、 35000条肽段，并且仪器稳定性高，动态范围宽，显示了Orbitrap 质谱出色的DIA定量能力。并且通过短梯度高通量的测试，15分钟短梯度即可定量超过4650个Hela蛋白，满足大规模临床样本等研究的高强度检测需求。
参考文献
1. Bruderer, R., et al, Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics 2015, 14, (5), 1400-10.
2. Dorte B. Bekker-Jensen , et al., A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Interface Improves Proteome Coverage in Short LC Gradients. Molecular & Cellular Proteomics, 2020, 19, 716–729.
仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。
Thermo Fisher Scientific
United States
