由于高效转导和安全性，重组腺相关病毒 (rAAV) 载体已成为基因治疗的主要基因传递载体。野生型 AAV 颗粒包含单链 DNA 基因组和由三种结构病毒蛋白（VP1、VP2和VP3）组成的衣壳，它们以大约 1:1:10 的比例组装病毒颗粒。每个VP在C端有一个重叠序列，仅在其N端区域不同。AAV衣壳的表面成分是参与细胞结合、内化和在靶细胞内运输的重要成分。需要对病毒蛋白进行完整表征，以确保AAV产品的安全性、质量和功效。
高效液相色谱质谱 (UHPLC-MS) 技术为衣壳蛋白表征提供了更快、更灵敏和更定量的方法，并且正在成为AAV衣壳蛋白表征的快速替代分析方法。与治疗性蛋白不同，AAV样品由于批量小，结构更复杂，样品量有限，滴度低，用于后续 UHPLC-MS 分析的衣壳蛋白量非常少。因此用于表征AAV病毒蛋白的分析平台需要具有更高灵敏度及精确度。本期小编分享两篇基于Orbitrap高分辨质谱仪和Biopharma Finder软件对AAV衣壳蛋白及其相关变体、HCP杂蛋白分析的应用方案。
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1.Highly sensitive intact mass analysis of AAV capsid proteins using a UHPLC-FLDHRAM MS platform
2.Adeno-associated virus capsid protein characterization and host cell protein profiling using micro-flow UHPLC-Orbitrap MS
一、AAV变性蛋白分子量分析
本研究在UHPLC-Orbitrap MS平台上分析了在 HEK293细胞系中表达的 AAV 血清型样品。变性的 AAV6 样品通过C4柱进行分离，荧光检测器定量分析。图 1 显示检测的病毒蛋白和相关 VP3片段以及截短的VP3形式。使用三种病毒蛋白（VP1、VP2 和 VP3）的积分峰面积，它们各自的比率估计为 1.3:1:10。
图1：AAV6 变性衣壳蛋白混合物的荧光图谱（点击查看大图）
Orbitrap质谱仪的高分辨率和高灵敏度等性能可实现蛋白的精确分子量检测。图2显示了 VP1、VP2 和 VP3 的原始质谱图和解卷积结果，上样量为560ng。质量偏差均小于3 ppm， 对于极低丰度的VP3片段和截短的VP3形式也可获得高质量谱图，质量偏差均小于 10 ppm。
图2：变性条件下15,000分辨率采集三种结构病毒VP蛋白质谱图（点击查看大图）
图3：不同上样量对应的VP1质谱图及分子量结果（点击查看大图）
AAV样品通常结构复杂，样品量有限，对分析仪器的灵敏度有更高的要求。UHPLC-Orbitrap 平台的卓越性能对于非常低丰度的AAV病毒蛋白也能实现准确的完整质量分析。图 3 显示了AAV6 样品不同进样量（28 ng, 56 ng, 140 ng）获得的 VP1 质谱图及解卷积结果。在整个进样范围内均能获得高质量质谱图，即使在28 ng上样量条件下，质量精度也低于 3 ppm。
二、AAV蛋白序列鉴定及HCP分析
在确定VP蛋白形式及分子量基础上，还需要对病毒蛋白进行全面表征，包括序列和翻译后修饰鉴定，以确保AAV产品的安全性、质量和有效性。此外，在AAV载体生产过程中，与AAV载体制造过程相关的杂质，例如来自生产细胞的宿主残留蛋白，也需要进行良好的表征和控制，以减轻免疫原性并确保产品稳定性。与治疗性蛋白质不同，AAV样品结构更复杂，样品量有限，用于后续LC-MS/MS分析的衣壳蛋白量很少。使用微流LC-MS/MS方法，切换更小内径色谱柱，与高流量 LC MS/MS 相比，可以减少 AAV6 样品的进样量，同时保持相当的方法稳定性和重现性。
肽图分析
尽管胰蛋白酶（trypsin）是肽图分析最常用的酶，但由于 AAV 衣壳结构稳定性高且trypsin切位点在 AAV 蛋白序列中的定位不理想，因此使用trypsin难以获得完整的病毒蛋白序列覆盖。最近的一项研究表明[1]，胃蛋白酶（pepsin）在酸性条件下具有热稳定性和活性，且可以改善病毒蛋白序列中有挑战性的序列表征。图 4显示pepsin酶解液的TIC图，使用PepMap 100 C18 色谱柱以 80 μL/min 的流速可以很好地分离肽混合物。使用高分辨率精确质量 MS 和 MS/MS 数据实现了100%的VP1 序列覆盖（图 4）。
图 4: AAV6的pepsin酶解液TIC图及VP1序列覆盖度结果（点击查看大图）
病毒蛋白具有相同的 C 端序列，仅在 N 端序列不同。因此，确认每个病毒蛋白的 N 端序列以识别所有病毒蛋白非常重要。UHPLC-Orbitrap 平台上获得的 高质量MS 和 MS/MS 图谱能够可靠地鉴定 VP1、VP2 和 VP3 N末端序列（图 5），包括乙酰化修饰N端。
图5：AAV6样品VP1、VP2、VP3蛋白N端序列的高质量MS/MS谱图（点击查看大图）
除了乙酰化，其他翻译后修饰，如病毒蛋白的磷酸化、脱酰胺和氧化，也从高质量的 MS 和 MS/MS 数据中鉴定出来。图6显示了肽 YYLNRTQNQSGSAQNKDLL 上的磷酸化位点（修饰比例仅为0.4%），由 MS/MS 数据可靠地鉴定。
图6：磷酸化肽段及非磷酸化肽段的XIC及MS/MS图（点击查看大图）
AAV6样品的宿主残留蛋白（HCP）的鉴定及相对定量
AAV6原液和纯化的AAV6样品的胰蛋白酶解液经过三次重复测样。纯化的AAV6样品三次重复的基峰色谱图如图7所示。使用微流液相色谱实现了出色的保留时间重现性和分离效率。原始数据通过Biopharma Finder软件处理分析（详细参数参考AN）。使用软件内置的comet搜索引擎对MS/MS的数据进行Uniprot-proteome_ UP000005640数据库检索从而鉴定HCP。
图7：纯化的AAV6样品三次重复实验BPC图（点击查看大图）
在AAV6原液中，817个HCP 被鉴定（至少鉴定到三个特征肽段）。如图 8 所示，尽管HCP中低含量的蛋白肽段（MARCKS）由于低强度信号而被隐藏在背景中，但 Orbitrap仍可获得高质量MS及MS /MS 质谱图，用于可靠的肽段鉴定。使用加标的 200 ng 完整链球菌蛋白 AG_chimeric 作为参考，使用其丰度最高的3条肽段平均峰面积计算出该 HCP 在 AAV6 原液中的浓度约为 3.6 pmol/mL[2]。此外，该方法表现出良好的重现性。三次重复运行的平均峰面积（前3个肽段）的变异百分比系数为 11%。
图8：低丰度HCP的鉴定和定量例举（紫色标注为低丰度HCP的肽段峰）（点击查看大图）
纯化后 HCP 的数量显着减少，从纯化的 AAV6 样品中仅鉴定出30种HCP。图 9显示了在原液和纯化的 AAV6 样品中鉴定的几种 HCP 的相对定量结果。总体而言，纯化的 AAV 样品中所有 HCP 的浓度均较低，这表明 POROS AAVX 亲和树脂能够有效地从 AAV6 原液中去除 HCP。
图9：AAV原液及纯化后的样品HCP定量趋势（点击查看大图）
本文总结 | Summary
本应用报告开发了一种稳健的微流LC-MS/MS方法，并成功应用于AAV6病毒蛋白的分子量、肽图分析以及预纯化和纯化的 AAV6 样品的 HCP 分析中。Orbitrap高分辨质谱可以使得样品获得高质量、高灵敏度的一级和二级谱图，实现病毒蛋白及其低丰度变体的准确分子量测量、100%序列覆盖度鉴定、可靠的低丰度位点特异性 PTM 鉴定和相对定量及HCP鉴定和相对定量分析。且所有数据可在同一套软件Biopharma Finder中实现，实现AAV样品流程化分析。
参考文献：
1. Toole, E.N.; Dufresne, C.P.; Ray, S.; Schwann, A.; Cook, K.; Ivanov; A.R. Rapid Highly Efficient Digestion and Peptide Mapping of Adeno-Associated Viruses. Anal. Chem. 2021, 93(30), 10403–10410. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c02117
2. Silva, J.C.; Gorenstein, M.V.; Li, G.Z.; Vissers, J.P.C.; Geromanos, S.J. Absolute Quantification of Proteins by LCMSE . Mol Cell Proteomics 2006, 5(1), 144-56.
@dongdan
Thermo Fisher Scientific
United States
