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技术专家
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由于高效转导和安全性,重组腺相关病毒 (rAAV) 载体已成为基因治疗的主要基因传递载体。野生型 AAV 颗粒包含单链 DNA 基因组和由三种结构病毒蛋白(VP1、VP2和VP3)组成的衣壳,它们以大约 1:1:10 的比例组装病毒颗粒。每个VP在C端有一个重叠序列,仅在其N端区域不同。AAV衣壳的表面成分是参与细胞结合、内化和在靶细胞内运输的重要成分。需要对病毒蛋白进行完整表征,以确保AAV产品的安全性、质量和功效。

 

高效液相色谱质谱 (UHPLC-MS) 技术为衣壳蛋白表征提供了更快、更灵敏和更定量的方法,并且正在成为AAV衣壳蛋白表征的快速替代分析方法。与治疗性蛋白不同,AAV样品由于批量小,结构更复杂,样品量有限,滴度低,用于后续 UHPLC-MS 分析的衣壳蛋白量非常少。因此用于表征AAV病毒蛋白的分析平台需要具有更高灵敏度及精确度。本期小编分享两篇基于Orbitrap高分辨质谱仪和Biopharma Finder软件对AAV衣壳蛋白及其相关变体、HCP杂蛋白分析的应用方案。

 

扫描二维码可免费获取AAV衣壳蛋白表征相关AN,后续将有工作人员与您联系。如有更多建议及软件使用心得,也欢迎与我们联系哦。

1.Highly sensitive intact mass analysis of AAV capsid proteins using a UHPLC-FLDHRAM MS platform

2.Adeno-associated virus capsid protein characterization and host cell protein profiling using micro-flow UHPLC-Orbitrap MS

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一、AAV变性蛋白分子量分析

 

本研究在UHPLC-Orbitrap MS平台上分析了在 HEK293细胞系中表达的 AAV 血清型样品。变性的 AAV6 样品通过C4柱进行分离,荧光检测器定量分析。图 1 显示检测的病毒蛋白和相关 VP3片段以及截短的VP3形式。使用三种病毒蛋白(VP1、VP2 和 VP3)的积分峰面积,它们各自的比率估计为 1.3:1:10。 

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图1:AAV6 变性衣壳蛋白混合物的荧光图谱(点击查看大图)

 

Orbitrap质谱仪的高分辨率和高灵敏度等性能可实现蛋白的精确分子量检测。图2显示了 VP1、VP2 和 VP3 的原始质谱图和解卷积结果,上样量为560ng。质量偏差均小于3 ppm, 对于极低丰度的VP3片段和截短的VP3形式也可获得高质量谱图,质量偏差均小于 10 ppm。

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图2:变性条件下15,000分辨率采集三种结构病毒VP蛋白质谱图(点击查看大图)

 

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图3:不同上样量对应的VP1质谱图及分子量结果(点击查看大图)

 

AAV样品通常结构复杂,样品量有限,对分析仪器的灵敏度有更高的要求。UHPLC-Orbitrap 平台的卓越性能对于非常低丰度的AAV病毒蛋白也能实现准确的完整质量分析。图 3 显示了AAV6 样品不同进样量(28 ng, 56 ng, 140 ng)获得的 VP1 质谱图及解卷积结果。在整个进样范围内均能获得高质量质谱图,即使在28 ng上样量条件下,质量精度也低于 3 ppm。

 

二、AAV蛋白序列鉴定及HCP分析

 

在确定VP蛋白形式及分子量基础上,还需要对病毒蛋白进行全面表征,包括序列和翻译后修饰鉴定,以确保AAV产品的安全性、质量和有效性。此外,在AAV载体生产过程中,与AAV载体制造过程相关的杂质,例如来自生产细胞的宿主残留蛋白,也需要进行良好的表征和控制,以减轻免疫原性并确保产品稳定性。与治疗性蛋白质不同,AAV样品结构更复杂,样品量有限,用于后续LC-MS/MS分析的衣壳蛋白量很少。使用微流LC-MS/MS方法,切换更小内径色谱柱,与高流量 LC MS/MS 相比,可以减少 AAV6 样品的进样量,同时保持相当的方法稳定性和重现性。

 

肽图分析

 

尽管胰蛋白酶(trypsin)是肽图分析最常用的酶,但由于 AAV 衣壳结构稳定性高且trypsin切位点在 AAV 蛋白序列中的定位不理想,因此使用trypsin难以获得完整的病毒蛋白序列覆盖。最近的一项研究表明[1],胃蛋白酶(pepsin)在酸性条件下具有热稳定性和活性,且可以改善病毒蛋白序列中有挑战性的序列表征。图 4显示pepsin酶解液的TIC图,使用PepMap 100 C18 色谱柱以 80 μL/min 的流速可以很好地分离肽混合物。使用高分辨率精确质量 MS 和 MS/MS 数据实现了100%的VP1 序列覆盖(图 4)。

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图 4: AAV6的pepsin酶解液TIC图及VP1序列覆盖度结果(点击查看大图)

 

病毒蛋白具有相同的 C 端序列,仅在 N 端序列不同。因此,确认每个病毒蛋白的 N 端序列以识别所有病毒蛋白非常重要。UHPLC-Orbitrap 平台上获得的 高质量MS 和 MS/MS 图谱能够可靠地鉴定 VP1、VP2 和 VP3 N末端序列(图 5),包括乙酰化修饰N端。

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图5:AAV6样品VP1、VP2、VP3蛋白N端序列的高质量MS/MS谱图(点击查看大图)

 

除了乙酰化,其他翻译后修饰,如病毒蛋白的磷酸化、脱酰胺和氧化,也从高质量的 MS 和 MS/MS 数据中鉴定出来。图6显示了肽 YYLNRTQNQSGSAQNKDLL 上的磷酸化位点(修饰比例仅为0.4%),由 MS/MS 数据可靠地鉴定。

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图6:磷酸化肽段及非磷酸化肽段的XIC及MS/MS图(点击查看大图)

 

AAV6样品的宿主残留蛋白(HCP)的鉴定及相对定量

 

AAV6原液和纯化的AAV6样品的胰蛋白酶解液经过三次重复测样。纯化的AAV6样品三次重复的基峰色谱图如图7所示。使用微流液相色谱实现了出色的保留时间重现性和分离效率。原始数据通过Biopharma Finder软件处理分析(详细参数参考AN)。使用软件内置的comet搜索引擎对MS/MS的数据进行Uniprot-proteome_ UP000005640数据库检索从而鉴定HCP。

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图7:纯化的AAV6样品三次重复实验BPC图(点击查看大图)

 

在AAV6原液中,817个HCP 被鉴定(至少鉴定到三个特征肽段)。如图 8 所示,尽管HCP中低含量的蛋白肽段(MARCKS)由于低强度信号而被隐藏在背景中,但 Orbitrap仍可获得高质量MS及MS /MS 质谱图,用于可靠的肽段鉴定。使用加标的 200 ng 完整链球菌蛋白 AG_chimeric 作为参考,使用其丰度最高的3条肽段平均峰面积计算出该 HCP 在 AAV6 原液中的浓度约为 3.6 pmol/mL[2]。此外,该方法表现出良好的重现性。三次重复运行的平均峰面积(前3个肽段)的变异百分比系数为 11%。

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图8:低丰度HCP的鉴定和定量例举(紫色标注为低丰度HCP的肽段峰)(点击查看大图)

 

纯化后 HCP 的数量显着减少,从纯化的 AAV6 样品中仅鉴定出30种HCP。图 9显示了在原液和纯化的 AAV6 样品中鉴定的几种 HCP 的相对定量结果。总体而言,纯化的 AAV 样品中所有 HCP 的浓度均较低,这表明 POROS AAVX 亲和树脂能够有效地从 AAV6 原液中去除 HCP。

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图9:AAV原液及纯化后的样品HCP定量趋势(点击查看大图)

 

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本文总结 | Summary

 

本应用报告开发了一种稳健的微流LC-MS/MS方法,并成功应用于AAV6病毒蛋白的分子量、肽图分析以及预纯化和纯化的 AAV6 样品的 HCP 分析中。Orbitrap高分辨质谱可以使得样品获得高质量、高灵敏度的一级和二级谱图,实现病毒蛋白及其低丰度变体的准确分子量测量、100%序列覆盖度鉴定、可靠的低丰度位点特异性 PTM 鉴定和相对定量及HCP鉴定和相对定量分析且所有数据可在同一套软件Biopharma Finder中实现,实现AAV样品流程化分析。

 

参考文献:

1. Toole, E.N.; Dufresne, C.P.; Ray, S.; Schwann, A.; Cook, K.; Ivanov; A.R. Rapid Highly Efficient Digestion and Peptide Mapping of Adeno-Associated Viruses. Anal. Chem. 2021, 93(30), 10403–10410. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c02117

2. Silva, J.C.; Gorenstein, M.V.; Li, G.Z.; Vissers, J.P.C.; Geromanos, S.J. Absolute Quantification of Proteins by LCMSE . Mol Cell Proteomics 2006, 5(1), 144-56.

 

@dongdan 
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