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mRNA疫苗在新冠疫情中得到了广泛关注,Moderna及Pfizer/BioNTech的mRNA疫苗获得FDA的紧急使用授权,掀起新一轮的mRNA疫苗研发热潮。与依靠抗原或减毒病毒刺激免疫系统产生免疫反应的传统疫苗不同,mRNA疫苗本身并不含有抗原,而是以编码抗原的mRNA为主要成分。这些编码抗原的mRNA能在细胞内被翻译为抗原蛋白,从而引发免疫反应。

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相比传统疫苗,mRNA疫苗成本低、研发灵活性高、生产效率高,且具有相对较高的安全性,应用前景广阔[1]。对于此类新型疫苗,需严格的质量控制以确保产品的安全性尤为重要。其质量属性包括稳定性、完整性、纯度和同质性等。如图1所示,从mRNA构造、体外翻译及转染,到体内免疫,色谱、质谱、qPCR、电泳等多种表征手段被用于质量评估[2]。其中高分辨质谱技术对于mRNA的深入表征(加帽效率、修饰、测序等)、杂质分析(siRNA、DNA、宿主残留蛋白)有着重要应用。

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图1:mRNA疫苗的质量控制和基于细胞的功能评估的工具(点击查看大图)


01 mRNA的加帽反应效率评估


mRNA前体的加工包括了在其5'端加上7-甲基鸟苷(m7G),称之为“帽”。这种加帽步骤可增加mRNA稳定性,使其避免被核糖核酸酶降解。加帽步骤会产生多种结构(如图2a),最常见的被称为“Cap0结构”(只含m7G),即鸟嘌呤环上的N-7位置甲基化;而如果下游邻位核苷酸上的核糖也被甲基化,则为“Cap1”,再下游的则为Cap2”(甲基化均发生在核糖的2'羟基上)。在脱磷酸的过程中,也会产生单磷酸、双磷酸、三磷酸等多种相关杂质。

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图2a.加帽反应(点击查看大图)

 

Oribitrap高分辨质谱由于其高分辨率、高灵敏度及高质量精度可以准确地对mRNA加帽效率进行评估。全长的mRNA直接通过LC-MS分析往往由于分子量太大而无法得到精确表征,通常会使用RNAse酶切结合磁珠分离的方法获得5’端的加帽短链,如图2b所示[3]。

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图2b.mRNA分离纯化步骤(点击查看大图)

 

RNAseH酶切及磁珠纯化分离后,所得的5’端mRNA酶解片段经过Orbitrap高分辨质谱分析,结果检测到未加帽组分、加帽1组分及少量在第二个A酶切位点得到的加帽1组分,包括单磷酸、二磷酸及三磷酸修饰杂质,且得到同位素基线分离的高质量谱图(如图3a、3b所示)。

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图3a.5’端mRNA 酶解片段TIC及质谱图(点击查看大图)

 

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图3b.5’端mRNA 酶解片段理论及实测质量(点击查看大图)

 

通过加入内标未加帽三磷酸mRNA,确认了质谱定量方法的可行性及准确性。对各加帽组分及未加帽组分形态进行质谱峰面积定量,从而得到5’加帽比例(图3c)。

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图3c.质谱非标定量法计算mRNA加帽比例(点击查看大图)


MRM方法用于mRNA加帽定量分析

 

质谱MRM方法可用于组织及细胞培养基中的mRNA加帽修饰检测,具有高通量及高灵敏等优势。组织或细胞培养基中的mRNA经过nucleaseP1酶解及磁珠纯化,可得到加帽二核苷酸,(m7)GpppN(m)[4]。对11个帽二核苷酸修饰变异体建立MRM方法(图4a),可实现每种变异体的色谱分离及质谱定量(图4b)。

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图4a.MRM质谱方法参数(点击查看大图)

 

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图4b.11个帽二核苷酸修饰变异体的提取离子流图(点击查看大图)

 

其中,对于m7GpppG及GpppGm形式的同分异构体,在液相及一级质谱上均无法分辨,而m7GpppG的特征子离子m/z635.9可将其区别于GpppGm,从而建立MRM方法定量分析,且方法灵敏度高(图5)。

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图5:(a)连续稀释的合成帽二核苷酸的峰面积测量;(b)连续稀释的合成帽二核苷酸GpppA的峰面积;(c) m7GpppG和GpppGm子离子信息;(d)连续稀释的合成帽二核苷酸m7GpppG的峰面积;(e)补偿m7GpppG和GpppGm的共享离子.(点击查看大图)


该方法可快速准确定量细胞中存在的mRNA帽结构,评估不同的加帽结构形态在不同组织或细胞中的含量变化(图6)。Orbitrap的定量能力可与三重四极杆相媲美,其PRM定量灵敏度高、准确性好,也可用于mRNA帽结构的定量分析中。

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图6:从小鼠肝脏、活化的CD8T细胞、心脏和大脑分离的mRNA帽二核苷酸的丰度(点击查看大图)

 

02 mRNA末端多聚腺苷酸Poly A 尾检测


真核mRNA通常在其3'末端带有一段多聚腺苷酸尾(PolyA tail),根据种类的不同,其长度可能在20到200多个碱基之间变化。PolyA tai会被多聚腺苷酸结合蛋白(poly(A)+ tail-binding protein,PABP)辨识并保护住,因此在mRNA的翻译和稳定性中也起着重要的调节作用。通常是在体外转录过程中直接从编码DNA模板或通过使用polyA聚合酶将最佳长度的polyA添加到mRNA中。PolyA的提纯方法类似5’加帽核酸片段,具体步骤可参考文献[5]。纯化后的polyA通常是含有不同长度腺苷酸的混合物,随着碱基个数的增加,HPLC液相方法的分辨率很难将不同长度的polyA完全分开,而Orbitrap高分辨质谱可以准确对其长度分布进行表征和相对定量。


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图7a.不同碱基长度的PolyA色谱图(b)理论100-merPloy A质谱解卷积结果(点击查看大图)

 

如图7a所示,当PolyA碱基个数在27时,液相色谱能将相差单个腺苷的polyA分开,随着碱基个数的增加,液相色谱很难实现相差单个腺苷的分辨。图7b显示理论100个碱基polyA的质谱表征结果,可准确得到每个不同长度polyA的质量数,其分布约为97-110个碱基,图中的每个质谱峰相差329Da,代表单个腺苷的差值,通过峰强度的信息,可对polyA长度分布进行相对定量。

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图8.85-mer RNA质谱图(点击查看大图)

 

对于碱基长度小于100的RNA(图8),Orbitrap高分辨质谱可实现同位素峰的基线分离,得到精确单同位素分子量信息(masserror<3ppm)。作者将经过前处理纯化后的PolyA(理论117-mer)进行质谱分析,得到不同长度的PloyA与质谱强度的关系图,其碱基长度分布在109-122之间,与Sanger测序结果一致(图9)。

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图9:(a)质谱强度与PolyA长度的关系图(理论117-mer的PolyA)(b)用于合成mRNA的质粒模板的Sanger测序结果(点击查看大图)

 

从临床的角度来看,评估体外转录mRNA中polyA尾的异质性很重要,而高分辨质谱可以作为一种高效的表征手段用于工艺研发和质量评估中。


03 RNA Mapping


相比二代测序,高分辨质谱作为互补表征技术,能够快速准确地分析RNA序列,同时对于翻译后修饰的种类、位点及含量进行深入表征。此外,也能对RNA代谢产物进行定性及定量分析。

 

对于长链RNA(>100mer),如dsRNA,可以先用特定酶将RNA酶解成更小的片段,再通过类似肽图分析的方式对碎片进行归属组合,确证序列覆盖度。如图10所示,dsRNA经过RNaseA/T1酶解,色谱分离后通过orbitrap高分辨质谱检测,得到RNA片段的精确一级分子量及丰富的二级碎片离子信息,从而获得全序列分析结果,正反义链序列覆盖度分别为82%及77%[6]。

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图10a.ds RNA酶解片段液相色谱图(点击查看大图)

 

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图10b.ds RNA正义链及反义链序列覆盖图(点击查看大图)

 

基于Orbitrap高分辨质谱的HCD碎裂方式能够获得RNA丰富的碎片离子,有效提高鉴定序列覆盖度,结合Thermo BioPharma Finder 4.0软件能够批量自动化的对碎片进行归属。在刚发布的BioPharma Finder 4.1版本中,加入了RNA Mapping功能,在方法编辑中可选择多种常见的RNAse酶,对于几十万分子量的长链RNA或DNA,可进行自动化全序列表征(图11)。

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图11:BioPharma Finder 4.1软件RNA Mapping功能(点击查看大图)

 

本文小结

 

mRNA作为一种新型疫苗平台具有广阔的前景,对其质量控制的法规要求也会愈加严格。Orbitrap高分辨质谱的高分辨、高灵敏度及高质量二级谱图等优异性能,能够更高效及深入地分析mRNA结构、修饰变异体及相关杂质,可用于mRNA疫苗的工艺优化及质量评估,提高其安全性及有效性。


参考文献:

[1]Norbert, P. et al. Defining the carrierproteome limit for single-cell proteomics. Nat Rev Drug Discov17(4), 261-279(2018)

[2]Cristina, B. et al. Establishing PreferredProduct Characterization for the Evaluationof RNA Vaccine Antigens. Vaccines 7, 131 (2019)

[3]Beverly M. et al. Label-free analysis of mRNA cappingefficiency using RNase H probes and LC-MS.Anal Chem 91, 13119-13127 (2019)Anal Bioanal Chem408(18), 5021-30(2016)

[4]Galloway A. et al. CAP-MAP: capanalysis protocol with minimal analyteprocessing, a rapid and sensitive approachto analysing mRNA cap structures.Open Biol 10, 190306 (2020)

[5]Beverly M. et al. Poly A tail lengthanalysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Anal BioanalChem (2018)

[6] Alison O. et al. Purification and characterisation of dsRNA using ion pair reversephase chromatography and mass spectrometry. J.ChromA 12, 062 (2016)

 

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