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技术专家
Team TFS
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新型冠状病毒(2019-nCoV)肺炎疫情来势汹汹,牵动着每一个人的心,在这没有硝烟的抗疫战场上,治疗药物是白衣天使手中的武器。我们整理了基于Orbitrap超高分辨质谱在抗病毒单克隆抗体药物中的应用,谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。

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得益于医药科研工作者的努力,很多药物已经用于新冠肺炎的治疗。比如治疗性新冠特免血浆制品投入临床,接受治疗的10余名危重病人重点指标全面向好,给危重病人提供了一种很好的治疗方案。在血浆制品中,只有针对病毒表面蛋白质的抗体才可能产生抗病毒的效果,即针对病毒的中和抗体。而大部分抗体缺乏抗病毒效应,他们可能带来细胞因子风暴的副作用。此外血浆制品的另一个缺点是难以量产。因此,鉴定出的中和抗体可以用于疫苗和单克隆抗体药物的开发,弥补血浆制品的不足。

 

如何在多克隆抗体中找到抗病毒作用的中和抗体?小编收集了基于Orbitrap高分辨质谱方法鉴定血清中单克隆抗体的相关文献,包括蛋白质组学的方法,蛋白质从头测序(De novo测序)、Top-down(自上而下)和Middle-down(自中而下)质谱技术。此外本文还简述了后续单克隆抗体初期研发和生产质控中基于Orbitrap高分辨质谱的全面、深入表征的解决方案。希望对医药科研工作者有所帮助。

 

方法1:蛋白质组学方法直接鉴定血清中单克隆抗体,应用于单克隆抗体药物的研发

 

Bottom-up(自下而上)蛋白质组学即先将蛋白酶解成肽段,然后通过色谱分离肽段混合物,再用质谱技术将肽段碎裂,根据碎裂谱图的离子峰信息进行数据库搜索来鉴定肽段,最后将鉴定的肽段进行组装、重新归并为蛋白。

 

本文提供了一种结合蛋白质组学和高通量测序技术(NGS)的方法直接从免疫动物血清的外周多克隆抗体中鉴定抗原特异性的单克隆抗体的方法。

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技术路线:


基于赛默飞 Orbitrap高分辨质谱仪的蛋白质组学技术进行免疫动物血清中单克隆抗体的鉴定(实验路线见下图)。免疫动物的血清用proteinA或G进行抗体亲和纯化和抗原亲和纯化,纯化后的多克隆抗体分别用多种酶酶切成肽段,接下来用nanoLC-Orbitrap HRMS分析。此外用高通量测序技术对免疫动物B细胞测序获得免疫球蛋白可变区(V-region)的序列,从而得到相对应的蛋白质数据库。质谱数据通过SEQUEST搜该数据库得到可变区氨基酸序列。接着在单一开放阅读框抗体表达平台合成和克隆抗体的重链和轻链。重组单克隆抗体在重链和轻链的基质中排列组合表达,与原多克隆抗体混合物的特异性和活性进行比较从而筛选出高活性的单克隆抗体。本文提供了一种有效分离病毒中中和抗体的方法,用于抗病毒的治疗。并且,它促进我们更加深入理解体液免疫反应。

3.png技术路线图(点击查看大图)

 

方法2:蛋白质De novo测序用于单克隆抗体的鉴定,应用于单克隆抗体药物的研发

 

蛋白质De novo测序:将蛋白分别用多种蛋白酶酶解成肽段,然后通过色谱分离肽段混合物,再用质谱技术将肽段碎裂,直接从碎裂谱图来推断多肽序列,再推断出蛋白序列。可以解决未知序列的蛋白质分析。

 

本文介绍了一种新利用蛋白质De novo测序的抗体发现的方法,这种方法只需要血清抗体,而不需要对遗传物质进行高通量测序。

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技术路线:


基于赛默飞 LTQ-Orbitrap高分辨质谱仪对巨细胞病毒感染人体的多克隆抗体从头测序得到单克隆抗体(实验路线见下图)。巨细胞病毒感染人体后产生多克隆抗体,多克隆抗体用proteinA进行亲和纯化和糖蛋白B抗原亲和纯化富集,用pH 3的洗脱液洗脱,再用离子交换色谱对高丰度的抗体进一步纯化,分别用多种酶对纯化的抗体进行胶内酶切成肽段,接下来用nanoLC-Orbitrap HRMS分析。对抗体MS/MS数据De novo测序分析,再结合分子量的信息筛选出可能的抗体序列组合,再在哺乳动物细胞中表达这些抗体,然后用ELISA实验对重组单克隆抗体进行功能验证。

5.png技术路线图(点击查看大图)

 

方法3:Top-down和Middle-down质谱技术用于单克隆抗体的鉴定和序列确证,应用于单克隆抗体药物的研发和确保抗体药物质量

 

Top-down质谱技术:蛋白无需酶解,通过完整蛋白质的质量及其碎裂谱图信息可以实现真正意义上的蛋白质鉴定,能保留多种翻译后修饰之间的关联信息。Middle-down质谱技术:蛋白用某些生物酶酶解,得到较长的肽段,对长肽段进行质谱分析,降低了Top-down的难度。

 

本文利用Top-down或Middle-down质谱技术可以解决高通量测序技术和Bottom-up蛋白质组学技术只能获得单抗轻链和重链的单链信息,而不知道轻链和重链是如何配对的问题。克服了单克隆抗体药物的发现和开发中重链和轻链配对确定的挑战。

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技术路线:


基于赛默飞 Orbitrap高分辨质谱仪的Top-down和Middle-down技术对IgG1 Fab段进行序列鉴定(实验路线见下图)。IgG1单抗用GingisKHAN蛋白酶酶切得到单抗Fab和Fc片段,用RP-LC C4色谱柱分离,赛默飞 Orbitrap高分辨质谱仪对Fab进行ETD直接碎裂,从而得到配对的轻链和重链信息。该方法可以用于对来自复杂抗体混合物中的单抗疫苗和药物的发现。

 

7.jpg技术路线图(点击查看大图)

 

方法4:单克隆抗体药物全表征,确保单克隆抗体药物质量

 

基于Q Exactive高分辨质谱仪平台和 BioPharma Finder 数据分析软件,实现了单克隆抗体药物简单、快速的完整分子量,亚基分子量,肽图,二硫键和糖型的分析(实验路线见下图),为单克隆抗体药物的初期研发和生产质控提供了高效、可靠的分析测试方法,赛默飞具有完整、全面的生物制药表征解决方案(Thermo AN-21919 & Thermo PN-64805等)。基于Orbitrap高分辨质谱仪的肽图和分子量分析,主要避免抗体氨基酸序列突变或丢失的克隆,确定蛋白分子的正确性。二硫键分析确保抗体空间结构的正确,防止二硫键错配影响单克隆抗体的活性。有的单克隆抗体中糖基化对活性非常敏感,糖型分析可避免一些糖型较差的克隆。

 

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8.1.jpg技术路线图(点击查看大图)

 

 

综上所述,基于Orbitrap高分辨质谱的蛋白质组学、蛋白质De novo测序、Top-down和Middle-down质谱技术可以用于单克隆抗体药物的发现和鉴定。以及在后续单克隆抗体初期研发和生产质控中,Orbitrap高分辨质谱平台可以帮助企业对其进行深入、全面的表征,从而保证抗体药物的有效性和安全性。

 

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