01 背景引入
乳制品是现代食品食品工业的重要组成部分，也是关系民生保障和国民体质的重要产业。而在当前国际形势面临高度不确定性、疫情进入“新常态”的背景下，维护中国乳制品行业及市场的持续健康发展更为重要。如何在后疫情时代保障国际乳品供应链通畅，满足中国消费者对安全、营养、健康乳品的需求，如何继续通过引进国际创新产品和技术，助力中国营养健康乳品发展，如何共建具有韧性的乳业体系，继续推动中国乳制品行业高质量、可持续发展，是我们共同面临的重要课题。
乳业是一个国家发达程度和食品消费现代化水平的重要标志，中国作为一个农牧业生产大国，也是乳品生产、消费和贸易大国。2019年，中国乳品进口数量307.7万吨，同比增长11.9%，金额116.4亿美元，同比增长10.2%。2010—2019年间，乳品进口额十年年均复合增长率达16.5%，可以说是中国消费者消费升级需求的一个缩影。
在乳制品中，最关键的营养成分就是蛋白质。蛋白质在牛乳中的含量约为3%-5%，其中主要分为酪蛋白和乳清蛋白两大类。酪蛋白为主要蛋白，占乳蛋白总量的80%-82%，主要有α-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白等亚型。根据氨基酸组成和电泳行为的不同，酪蛋白可分为αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占牛乳酪蛋白总量的30-35％。β-酪蛋白又存在多种变体，最常见的是a1β-酪蛋白和a2β-酪蛋白，两者的区别在于氨基酸链的第67位存在变异，前者为组氨酸，后者为脯氨酸。a1β型酪蛋白水解容易产生β-酪啡肽-7（BCM-7）。a2β型脯氨酸因为空间位阻，不容易产生BCM-7。BCM-7可能影响神经、内分泌和免疫系统中的阿片受体，与1型糖尿病、冠心病、动脉硬化、婴儿猝死综合征、自闭症、精神分裂症等相关。在牛乳中，既含有a1β-酪蛋白又含有a2β-酪蛋白的乳品为A1/A2型奶，只含有a2β-酪蛋白的乳品为A2型奶，只含有a1β-酪蛋白的乳品为A1型奶。其中A2型奶属于高端细分品类，价格普遍高于普通牛奶。因此，利用这一差异性，可以鉴定乳制品的质量以及是否掺假等。
02 鉴定策略
常用的对乳制品中酪蛋白鉴定方法有：
1） 定量PCR
此方法具有易操作，能同时实现定性，定量的优点，但对加工制品不适用。
2） ELISA
此方法也易于操作，但仅局限于目标蛋白以及近亲缘种属之间同源干扰，而且同样不适用于加工食品。
3） 质谱检测
质谱检测方法不受食品加工过程的影响，而且可以同时定性定量，实验结果可靠，灵敏度高，并能对多种掺假进行检测。
03 β-酪蛋白质谱检测
针对乳制品中β-酪蛋白的质谱检测，科研工作者采用了不同的鉴定方法，分别对β-酪蛋白进行了系统且全面的分析。
蛋白质组学策略对β-酪蛋白定量：
如下图所示，常见的蛋白质组学策略有两种，分别是Bottom-up以及Top-down策略。两种策略各有优势。
图1. 两种蛋白质组学分析策略
#1「 Bottom-up策略对β-酪蛋白定量 」
通过提取牛奶中的蛋白，加入胰酶酶切，然后进行质谱定量。通过使用特征肽段对不同亚型的β-酪蛋白进行定量（如图2），就可以对乳制品的质量进行判定。这种方法灵敏度高，稳定性好，并且对牛奶中其他蛋白的定量同样适用。
图2. β-酪蛋白特征肽段的质谱峰
并且，利用Orbitrap独有的PRM检测模式可以快速建立二级定量方法，对靶标β-酪蛋白等，具有更好的稳定性和灵敏度。
针对乳制品中的掺假行为，比如在牛奶中加入其他种属的乳制品，利用质谱的Bottom-up策略也可以做出很好的检测。这主要是因为不同种属的同一蛋白在氨基酸序列上存在的一定差异（图3），而质谱就是检测氨基酸序列的最有效的武器。
图3. 不同种属的同一蛋白在氨基酸序列差异以及特异肽标准品质谱图
通过找到不同种属之间乳蛋白的特异性肽段，可以对乳制品中来自不同种属的蛋白进行定量，也可以用于区分来自不同种属的乳制品。另外，这种策略还可以用来研究牛奶中蛋白在逐步消化酶解过程中蛋白的变化。综上，这种Bottom-up策略操作相对简单，对仪器以及后续分析要求小，普及性较强。
#2 「 Top-down策略对β-酪蛋白定量 」
蛋白组学的Top-down策略，因其更能反映蛋白质不同的修饰和选择性剪切状态，也受到了很多研究者的青睐。如利用β-酪蛋白不同亚型分子量以及保留时间的差异，可以对β-酪蛋白进行定量，同时也可以对酪蛋白的糖基化程度进行评价。并且Top-down定量方法具有良好的稳定性和重现性，也被众多蛋白结构研究学者所衷爱。
图4. β-酪蛋白Top-down策略分析相关信息
#3 「 乳制品中的糖基化修饰研究 」
基于Orbitrap 的超高分辨质谱，不仅能对蛋白进行精准定性与定量，还能够对蛋白翻译后修饰进行研究。
食品蛋白质的翻译后修饰结构可能在加工过程中发生改变，从而影响食品的营养特性。而且，母乳中对新生儿的生长、发育、保护和健康至关重要的蛋白质往往会发生至关重要的聚糖高度修饰。来自国内的科研工作者利用质谱技术，对乳制品中的糖基化修饰进行了检测（图5）。
研究者通过糖肽富集、液相色谱分离和串联质谱分析，定量比较了牛奶和酸奶中蛋白质N-糖基化修饰的差异。共鉴定出181个N-糖苷，其中142个首次在牛奶和酸奶中定量。在将牛奶发酵成酸奶后，其中13个N-糖苷的丰度发生了明显的变化。酸奶中大多数乳蛋白的N-糖基化状态保持相对不变，表明发酵过程中乳蛋白的构象、活性和功能保持不变。主要的乳蛋白中，组织蛋白酶D的N241和乳过氧化物酶的N358在乳酸发酵生产酸奶后显著降低。综上所述，这篇文章对牛奶和酸奶的n糖蛋白组进行了定量比较，证明了酸奶发酵过程会导致某些乳蛋白的N-糖基化发生变化。
图5.乳制品中糖基化修饰研究
04 总结
与传统的蛋白鉴定方法相比，乳制品中蛋白含量的质谱检测方法，不仅能够避免加工过程中的各种干扰，还可以高通量，大规模对蛋白进行检测。通过基于Orbitrap 的超高分辨质谱技术，我们不仅能够快速准确地对乳制品中蛋白含量进行精准定性与定量，还可以对酶解过程中蛋白的动态变化、空间结构、翻译后修饰以及脂质组学等进行研究，质谱检测在乳制品检测中具有重要作用。
参考文献
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Thermo Fisher Scientific
United States
