磷酸化修饰作为生物体内极为重要也是最为广泛的一种翻译后修饰，调节着信号转导、细胞生长分化、免疫应答、疾病发生发展等几乎所有重要的生命活动。在新冠肺炎全球流行的大背景下,依然需要挖掘SARS-CoV-2感染的分子机制及开发有效的治疗剂。下面我们来速览两篇磷酸化蛋白质组学用于SARS-CoV-2感染机制研究的文章~
Cell：磷酸化蛋白组揭示SARS-CoV-2感染新机制
新冠肺炎的全球流行，仍然迫切需要有效的SARS-CoV-2治疗剂。本文中运用定量蛋白质组学研究方法，通过分析宿主和病毒蛋白上磷酸化的变化，量化SARS-CoV-2感染后VeroE6细胞的生命活动进程，从而揭示了COVID-19的发病机制，并确定了具有SARS-CoV-2治疗潜力的药物。[1]
借助Easy nLC 1200 - Orbitrap Exploris 480分析平台，研究人员首先对SARS-CoV-2感染0h、2h、4h、8h、12h和24h的Vero E6细胞进行蛋白质组和磷酸化组综合分析，采用8m/z隔离窗口的DIA蛋白质组学方法对每个样品分析总体蛋白丰度和磷酸化的变化（图1A）。
结果显示在感染过程中观察到受调节的磷酸化位点和蛋白质的数量显著增加，大部分调节发生在磷酸化水平，而不是蛋白水平。这表明磷酸化信号代表了感染这一时间过程中的主要宿主反应。
图1. SARS-CoV-2感染后磷酸化和蛋白丰度变化。A, 分析方案; B, 磷酸化聚类分析; C, 蛋白质丰度(AB)和磷酸化位点(PH)在组内(红色)和组间(黑色)之间的相关性; D, 不同SARS-CoV-2蛋白的丰度分析; E, 感染24小时磷酸化位点的火山图分析; F, 感染24小时后蛋白丰度的火山图分析; G. 差异蛋白富集分析。（点击查看大图）
蛋白合成以后，酶可以通过对蛋白进行化学修饰来改变它的活性。激酶及磷酸化在调节细胞间通信、细胞生长和细胞死亡等许多重要过程中起着关键作用。为了研究激酶信号传导的整体变化及其对宿主蛋白质磷酸化的影响，使用聚类方法根据其变化动态将受调控的磷酸化位点分为五类（图2）。对97种激酶进行分析，发现激活上调最强的是p38途径的几个激酶，他们可抑制Rho信号传导；被下调的激酶包括几种细胞周期相关激酶（CDK1/2/5和AURKA）、细胞生长相关的信号通路激酶（PRKACA、AKT1/ 2、MAPK1/3和PIM1）以及细胞骨架调节剂（PAK1）等。将激酶活性与下游蛋白质复合物整体分析，构建宿主激酶与SARS-CoV-2病毒蛋白互作示意图。
图2. 宿主细胞应对SARS-CoV-2感染的信号变化。A, 聚类分析结果图; B, 感染后激酶的活性发生了强烈变化; C, 宿主激酶与SARS-CoV-2病毒蛋白相互作用示意图。（点击查看大图）
磷酸化蛋白组学数据表明，SARS-CoV-2感染过程中，与细胞骨架组织相关的几种激酶和效应蛋白受到调控。Rho/Rac/Cdc42 GTPases下游的激酶(PAK1/2和ROCK1/2)、波形蛋白(VIMS39和S56)和抑微管装配蛋白(STMN1 S16和S25)中的几个磷酸化位点靶点下调。在SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞中，观察到丝状肌动蛋白和SARS-CoV-2的M蛋白簇，这可能标志着SARS-CoV-2病毒颗粒的聚集主要分布在富含肌动蛋白的丝状足部。与未感染的细胞相比，SARS-CoV-2感染细胞的丝状突起明显更多，沿着丝状伪足清晰可见组装的病毒颗粒（图3A~C）。
另外，SARS-CoV-2感染促进p38/MAPK信号活性和细胞周期阻滞，一系列免疫印迹实验都表明，在表达ACE-2的A549人肺癌细胞感染SARS-CoV-2期间，p38/MAPK通路是激活的（图3D）。将SARS-CoV-2感染细胞的磷酸化蛋白质组学表达图谱与特定细胞周期的磷酸化图谱进行比较，发现病毒感染与S/G2期过渡阻滞的细胞高度相关，与细胞的磷酸化图谱呈负相关。激酶拥有某些结构特征，使其成为良好的药物靶标，用激酶抑制剂筛选SARS-CoV-2药物，通过将磷酸化图谱映射到失调的激酶和途径，共鉴定出了87种药物和化合物。研究人员发现p38、CK2、CDK、AXL和PIKFYVE激酶的药理抑制作用具有抗病毒功效，可能是潜在的COVID-19疗法。
图3. 宿主细胞应对SARS-CoV-2感染的信号变化。A, 磷酸化位点调控途径参与细胞骨架重排; B, 共聚焦切片结果; C, SARS-CoV-2感染细胞的丝状突起显著增加；D, 免疫印迹验证实验; E, 热图分析，比较SARS-CoV-2感染Vero E6磷酸化谱与诱导DNA损伤和细胞周期停滞的表达图谱。（点击查看大图）
小 结
作者使用基于质谱的方法，对SARS-CoV-2不同感染时间的蛋白质丰度和磷酸化水平进行定量、整合分析。在24小时内宿主蛋白丰度变化较小，但磷酸化水平观察到很大的变化，磷酸化的变化反映了在感染期间被劫持的激酶活动的改变，是理想的药物靶点，激酶活性的变化为病毒感染的生物学研究提供新思路。
Molecular Cell：磷酸化蛋白组洞悉病毒感染后宿主内的信号通路重塑和机体应答
作为COVID-19大流行的病原体SARS-CoV-2，该病毒感染肺泡上皮2型细胞(AT2s)，导致肺损伤和气体交换受损，但驱动感染的机制和病理尚不清楚。研究人员对在气液界面(ALI)感染SARS-CoV-2的诱导多能干细胞衍生的AT2s细胞(iAT2s)进行了定量磷蛋白组学研究。[2]
原代2型肺泡上皮细胞(AT2s)很难在体外培养，所以研究者首先通过体外诱导多能干细胞体系诱导培养2型肺泡上皮细胞（iAT2s）（图4A），并对iAT2s感染新冠肺炎病毒1h、3h、6h和24h四个时间收集样品，采用TMT16-plex高通量分析策略，在Q-ExactiveHF-X质谱上进行TMT标记的定量蛋白组和磷酸化修饰组学研究（图4B）。如图4C所示，共鉴定到8471个蛋白（其中有8个病毒蛋白），以及位于2个病毒蛋白和2703个宿主蛋白上的14289个磷酸化位点。其中有2872个差异蛋白，包括对AT2s细胞表面活性剂功能至关重要的marker蛋白SFTPA2；同时也鉴定到1166个肺部特异性表达蛋白上的4688个差异磷酸化位点。
图4. iAT2s细胞磷酸化蛋白组分析策略。A,实验模型设计; B,数据采集流程; C, 分析结果与验证。（点击查看大图）
为了表征iAT2宿主对感染的初始反应，作者将早期感染时间点(1-6h)细分为感染片刻（1h）、早期感染（3h）以及中后期感染（3-6h）三部分，并对iAT2s宿主蛋白改变进行聚类分析。Cluster1与病毒侵入后以及迅速免疫应答相关，Cluster2-4富集的蛋白与细胞增殖调控相关。与此结果一致的是，免疫荧光结果显示，在SARS-COV-2感染的iAT2s中显著降低了PCNA蛋白的表达水平，表明病毒感染诱导了宿主细胞间期阻滞。
图5. 感染的iAT2s宿主蛋白变化。A, 感染1/3/6h后的蛋白丰度聚类分析; B,不同Cluster的蛋白功能注释; C, 感染24h的差异蛋白火山图分析; D, 免疫荧光法检测对照组和实验组的iAT2s的 PCNA蛋白表达水平。（点击查看大图）
另外，本研究还对宿主和病毒应答机制进行了分析和验证。时间过程动态分析揭示了多种宿主系统的快速重构，其中包括信号转导、RNA加工、翻译、代谢、核完整性、蛋白运输和细胞骨架-微管组织等，导致细胞周期阻滞、基因毒性应激和先天性免疫。通过与转化细胞系的类似数据比较，发现SARS-CoV-2干扰了呼吸特异性过程，突出了潜在的新型治疗途径，并在靶向小分子筛选过程中得到了高概率的验证。
结语
随着蛋白质组研究的深入，结合DIA、TMT等高通量高准确性的分析手段，将定量蛋白质组与磷酸化蛋白质组双管齐下，多维度解析病毒感染相关的生命活动机制，对更好地筛选疾病生物标志物、鉴定药物靶点等都具有重要意义。
关键词：SARS-CoV-2，修饰蛋白质组学，高通量分析
参考文献
1. MehdiBouhaddou, et al. The Global Phosphorylation Landscape of SARS-CoV-2Infection. Cell. 2020.
2. RyanM. Hekman, et al. Actionable Cytopathogenic Host Responses of HumanAlveolar Type 2 Cells to SARS-CoV-2. Molecular Cell. 2020.
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Thermo Fisher Scientific
United States
