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融合蛋白技术实现了无需化学修饰和复杂制剂即可达到蛋白和多肽药物长效性的目的。这一优势极大降低了蛋白、多肽药物的给药频率。因此,自1998年FDA批准第一个融合蛋白依那西普(商品名:Enbrel)以来,大量融合蛋白研究项目启动。仅2011-2016年间,FDA批准上市的融合蛋白药物就已占所有获批上市治疗性蛋白药物的17%  [1]。典型融合蛋白结构示意图,如图1所示 [2,3]

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图1 典型的融合蛋白结构示意图

 

综合ICHQ5、ICHQ6B、WHO、美国FDA相关指南、《中国药典》重组DHA技术产品总论、人用重组单克隆抗体制品总论相关法规以及部分书籍中融合蛋白的评价参数如表1所示。

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表1 典型的融合蛋白质量评价参数

从表1可以看到,很多质量属性的表征均需要LC-MS技术。图2对比了融合蛋白(Etanercept)与典型单抗(Trastuzumab)的结构。由于融合蛋白的高度复杂性,对LC-MS的性能要求高于普通蛋白药物。本文以Etanercept为例,讲解融合蛋白的表征方法。

 

1)分子量检测,糖基化位点增加导致蛋白的异质性高。为了实现尽可能多的修饰的准确鉴定,要求质谱具有较高的灵敏度和分辨率;

2)糖肽的鉴定。要求质谱具有较高的一级质量精度和丰富的二级碎裂,提升糖肽鉴定的可靠性;

3)二硫键鉴定,二硫键过于密集导致多对二硫键存在于同一组肽段中。

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图2   融合蛋白(Etanercept)与单抗Trastuzumab对比图

 

01#  分子量分析

 

由于多个N糖基化位点和O糖基化位点,以及各糖基化位点丰富的糖链类型让融合蛋白与单抗相比具有更高的异质性,导致该类融合蛋白无法直接进行分子量测定。PNGaseF和神经氨酸酶去除N糖和唾液酸后或N、O糖试剂盒去除N、O糖后,融合蛋白的异质性得到极大的降低。在Orbitrap的高灵敏度下,可实现不同修饰融合蛋白的分子量检测(图3)。

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图3 Etanercept分子量分析结果图

 

02#  肽 谱

 

HCD的高能碎裂模式可为肽段获得丰富的二级碎片,增加肽段鉴定的可靠性,从而为序列覆盖度提供保障(图4)。即使是CID难以碎裂的O糖肽,也可以在HCD碎裂中得到丰富的二级碎片(图5),再结合Orbitrap的高灵敏度和高的质量精度(一级和二级质量精度),实现基于糖肽的糖基化位点和糖型鉴定。5.png

图4 仅用trypsin即可实现Etanercept氨基酸序列100%覆盖度

 

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图5 Orbitrap检测+HCD碎裂模式下,Etanercept的O糖肽鉴定

 

三合一质谱的EThcD碎裂模式是HCD碎裂和ETD碎裂的组合,结合了HCD和ETD碎裂的优势,可为O糖基化位点和O糖肽的鉴定提供丰富的c、z和b、y离子,极大提高O糖肽和糖基化位点鉴定的可靠性 [4],图6。7.png

图6 GLP1-Fc 融合蛋白(上)O糖基化鉴定

 

03#  二硫键分析

 

Etanercept的氨基酸数目远少于IgG类单抗,但二硫键数目(26对)远多于IgG类单抗(16对)。即使采用多酶酶切,也存在一条肽段中包括多对二硫键的现象。此外,部分二硫键所在肽段还包含糖基化位点。多对二硫键、糖基化位点和长肽段的存在,极大降低了肽段二级碎片的响应和数目,为二硫键的鉴定增大了难度。 

 

因此,二硫键的鉴定是融合蛋白分析中较为困难的部分。提高前体离子的质量精度、二级碎片的数目和二级碎片的质量精度,具有高灵敏度、高质量精度和和多种碎裂模式的Orbitrap是最理想的选择。图7展示了Orbitrap鉴定融合蛋白Etanercept二硫键的思路。8.png

图7 Etanercept二硫键鉴定的难点

 

无论是双酶酶切还是三酶酶切,Orbitrap均可实现Etanercept 26对二硫键的全部鉴定(图8)。9.png

图8 Orbitrap三酶酶切和双酶酶切鉴定Etanercept 26对二硫键

 

由于Orbitrap的高灵敏度,即使是包含多对二硫键的长肽段,也可获得丰富的二级碎片。以包含二硫键C18-C31/C32-C45/C35-C53的肽段为例,如图9所示,每一条肽段均可获得丰富的二级碎片,实现肽段序列全覆盖。10.png

图9 Enancerpt二硫键C18-C31/C32-C45/C35-C53的鉴定

 

此外,Orbitrap的ETD+HCD碎裂模式,还可以进一步确定肽段复合物中二硫键的连接方式。如图10所示,ETD碎裂使二硫键被打碎释放出肽段,证明该复合物的确是由下列四条肽段之间通过二硫键相连接。HCD进一步碎裂所得肽段,进一步证明肽段的连接顺序。11.png

图10 ETD碎裂Etanercept二硫键

 

04#  O糖链鉴定

 

与N糖链不同,O糖链没有专属性的内切酶可用于O糖链的释放。采用外切酶释放糖链并荧光标记后鉴定,图11。根据荧光的强度计算的三种糖型所占的比例分别为35.4%,54.0%和10.6%。质谱测得结果中各糖型测得质量与理论质量相比,质量偏差都在3 ppm以内。12.png

 图11 Etanercept O糖链的定量和定性分析

 

05#  体积变异体

 

体积变异体包含高聚体(high molecular weight, HMW)和片段(Fragmentation, Low molecular weight, LMW)。HMW可能导致过敏等不良反应的出现,LMW导致蛋白药物有效性的降低和副作用的产生。从生产到存储的任何一个环节都可能导致体积变异体的发生。检测体积变异体的方法很多,但MS仍然是最为强大的定性手段(图12)。13.png

图12 体积变异体的检测方法

 

Orbitrap丰富的产品系列可实现从HMW到LMW的分析 [5,6],如图13所示。14.png

图13 Orbitrap用于体积变异体的分析

 

06#  电荷变异体

 

与体积变异体一样,电荷变异体同样影响着蛋白药物的有效性和安全性。但电荷变异体的两种主要分离方法(离子交换)和电泳均与MS分析条件不兼容。如何实现电荷异构体从分离到鉴定的良好衔接一直是蛋白药物分析者关注的对象(图14)。15.png

图14 常见电荷异构体的分离、鉴定方法

 

ThermoFisher强大的离子交换色谱柱Propac WCX和Mabpac SCX为无需更换质谱前端的电荷异构体分离鉴定提供了方便(图15)。16.png

图15 离子交换-Orbitrap实现抗体药物电荷异构体分析 [7]

 

同时,ThermoFisher与iCIEF著名的生产厂商AES的co-marketing合作也为希望获得更高分离鉴定能力的客户提供了思路 (图16)。17.png

图16 iCIEF-Orbitrap实现抗体药物电荷异构体分析 [8]

 

结语

 

Orbitrap的高稳定性、高灵敏度、宽线性范围和高分辨率带来的高质量精度,为融合蛋白的定性和定量分析提供可靠数据。同时,Orbitrap的高性能还为生物制药的其它领域,如单抗、双抗、ADC药物、核酸(DNA探针、小核酸药物和mRNA) 、多肽药物、重组蛋白药物、疫苗 的研发、临床和DMPK提供全方面解决方案。

 

 关键词 :高分辨质谱,融合蛋白,分子量,二硫键,肽谱,糖肽,体积变异体,电荷变异体

 

参考文献:

[1] 王军志, 生物技术药物研究开发和质量控制, 科学出版社,  2018, 第18章, pp 670-671.

[2] B.L. Duivelshof, A. Murisier, J. Camperi, S. Fekete, A. Beck, D. Guillarme, V. D'Atri, Therapeutic Fc‐fusion proteins: Current analytical strategies, Journal of Separation Science 44(1) (2021) 35-62.

[3] A.L. Linderholm, S.M. Chamow, Immunoglobulin Fc-Fusion Proteins, BioProcess International 12 (2014) 10.

[4] N. Hashii, J. Suzuki, H. Hanamatsu, J.-i. Furukawa, A. Ishii-Watabe, In-depth site-specific O-Glycosylation analysis of therapeutic Fc-fusion protein by electron-transfer/higher-energy collisional dissociation mass spectrometry, Biologicals 58 (2019) 35-43.

[5] Y. Yan, A.P. Liu, S. Wang, T.J. Daly, N. Li, Ultrasensitive characterization of charge heterogeneity of therapeutic monoclonal antibodies using strong cation exchange chromatography coupled to native mass spectrometry, Analytical chemistry 90(21) (2018) 13013-13020.

[6] Y. Yan, T. Xing, A.P. Liu, Z. Zhang, S. Wang, N. Li, Post-Column Denaturation-Assisted Native Size-Exclusion Chromatography–Mass Spectrometry for Rapid and In-Depth Characterization of High Molecular Weight Variants in Therapeutic Monoclonal Antibodies, Journal of the American Society for Mass Spectrometry  (2021).

[7] R.L. Shi, G. Xiao, T.M. Dillon, M.S. Ricci, P.V. Bondarenko, Characterization of therapeutic proteins by cation exchange chromatography-mass spectrometry and top-down analysis, mAbs 12(1) (2020) 1739825.

[8] T. Chen, T. Kwok, A.R. Esmin, V. Li, G. Rozing, T. Huang, High-Efficiency Preparative Imaged Capillary Isoelectric Focusing (iCIEF) and iCIEF-MS Protein Charge Variant Characterisation, interface 7 (2021) 11.

 @dongdan 

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