前言
淀粉样蛋白沉积（Amyloidosis）涉及一系列复杂的疾病，其以错误折叠的蛋白质在细胞外异常沉积为主要特征。错误折叠的蛋白质有时会因为不能溶解而从蛋白酶体介导的降解途径中逃脱，然后通过形成beta-pleated sheets进一步形成输水结构，在GAGs(glycosaminoglycans) 和SAP(serum amyloid P)的稳定作用下，聚集成寡聚物，进而形成淀粉样纤维在各种组织上沉积。长期的蛋白沉积会导致组织微环境的改变，并导致组织衰竭。其中最主要受到沉积攻击的组织为心脏和肾脏。
图1.淀粉样蛋白沉积的病理（点击查看大图）
每种不同症状的淀粉样蛋白沉积都是由特异的错误折叠蛋白造成的。例如β淀粉样蛋白（amyloid beta）在脑组织中沉积会导致艾滋海默症。目前已知的淀粉样蛋白沉积约有30种，其中一些是遗传性的，一些则是后期获得性的。其中四种最为常见的类型为:轻链型（light chain, AL）由IgG轻链沉积引起;炎症型（inflammation,AA）由Serum amyloid A protein （SAA）沉积引起；透析型（dialysis,A β2M）由β2 microglobulin沉积引起；遗传和老年型（hereditary and old age, ATTR）由transthyretin沉积引起。这四种类型占到所有淀粉样蛋白沉积的90%以上[1]。
图2.各种淀粉样蛋白沉积和其对应的沉积蛋白质（点击查看大图）
淀粉样蛋白沉积的诊断
淀粉样蛋白沉积的诊断通常分成两个步骤。首先需要对皮下脂肪活检，或者进一步对靶组织活检，采用刚果红（Cargo Red）染色，以确定存在淀粉样蛋白沉积。随后需要采用各种手段来对沉积蛋白进行鉴定以区分淀粉样蛋白沉积的亚型。
对于沉积亚型的诊断非常重要，因为不同亚型的临床症状可能类似但干预手段却不尽相同。例如遗传型亚型（ATTR）通常导致心血管疾病，一般用肝移植来治疗；而轻链型（light chain, AL）沉积，虽然临床症状可能相同，但需要采用干细胞移植来进行治疗。
图3.淀粉样蛋白诊断决策树（点击查看大图）
传统的亚型诊断通常采用免疫组化的方法来检测不同的沉积蛋白。然而免疫组化并不能提供非常确信的结果，主要由于以下几个原因:
- 血浆蛋白的污染；
- 福尔马林固定引起的蛋白质交联导致了抗原表位的丢失；
- 缺乏特异性的抗体。
虽然后续还有其他一些优化的生化手段，但通常都需要较多的组织且难以避免血浆或者其他非沉积组织蛋白的干扰。
蛋白质组学用于淀粉样蛋白沉积的亚型诊断
基于质谱的蛋白质组学在蛋白质鉴定上具有天然的优势。在传统的蛋白质组学中我们通常使用纳升级液相来进行肽段分离以提升检测的灵敏度。这一特性对于淀粉样蛋白沉积的诊断则显得非常具有吸引力，因为我们可以使用激光显微切割得到纯净的不受非沉积组织干扰的微小组织切片从而进行蛋白质组学的分析来鉴定沉积蛋白。事实上，激光显微切割结合蛋白质组学的方法在北美的第三方大型独立医学实验室已经成为淀粉样蛋白沉积亚型诊断的最为主流的方法[2,3]。
淀粉样蛋白沉积亚型诊断的过程是一个非常蛋白质组学的工作流程，主要包含下面几个步骤：
（1）对靶器官活检组织（石蜡包埋）进行刚果红染色；
（2）在刚果红染色的指引下使用激光显微切割切取直径245um，厚度10um左右的阳性微小组织块；
（3）对切割组织进行蛋白抽提，变性，随后胰酶酶解并进行质谱检测，得到的肽段通常在1-2ug量级；
（4）用数据库搜索软件搜库鉴定（使用人的经典全库），使用PSM hits数进行非标记半定量；
（5）考虑丰度最高的淀粉样变性蛋白结合其他临床指标进行亚型诊断（图4）。
图4.基于激光纤维切割-蛋白质组学的淀粉样蛋白沉积亚型诊断过程（点击查看大图）
图5.对刚果红染色阳性区域进行激光显微切割和该区域的蛋白质鉴定结果（点击查看大图）
对刚果红染色阳性区域进行蛋白质组学鉴定，我们通常会鉴定到3类蛋白质，一是非淀粉样变性蛋白，二是淀粉样蛋白沉积共有的蛋白，例如图5中的APOE,APOA4, SAMP和APOA1，三是亚型特异的沉积蛋白，例如图5中的IgG kappa chain, 则提示了该病理组织为轻链型（light chain,AL）淀粉样蛋白沉积。在Vrana等人2009年发表在Blood的工作中这种蛋白质组学诊断方法对41份病理样本中的40例进行了完全正确的诊断，而作为对照的免疫组化方法仅有42%的检出率。
图6.激光纤维切割-蛋白质组学方法诊断淀粉样蛋白沉积亚型的临床表现[3]（点击查看大图）
结论
Obitrap在医学领域表现出了非常广泛的应用范围。其不仅可以和常规液相联用，用于定量蛋白质标志物（例如IGF1），也可以和纳升级液相联用采用蛋白质组学的策略对病理组织进行分型。相信在日后的研究和日常工作中，orbitrap系列高分辨质谱还将向我们展示更多的可能性。
参考文献
1. Magy-Bertrand, N., et al., Incidenceof amyloidosis over 3 years: the AMYPRO study. Clin ExpRheumatol, 2008. 26(6): p. 1074-8.
2. Klein, C.J., et al., Massspectrometric-based proteomic analysis of amyloid neuropathy type innerve tissue. Arch Neurol, 2011. 68(2): p. 195-9.
3. Vrana, J.A., et al., Classificationof amyloidosis by laser microdissection and mass spectrometry-basedproteomic analysis in clinical biopsy specimens. Blood, 2009.114(24): p. 4957-9.
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Thermo Fisher Scientific
United States
