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技术专家
Team TFS
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关键词:
代谢组学、合成生物学、 GC-Orbitrap/MS、

RBS-promotor、多元统计、高分辨率高质量精度(HRAM)

 

目标


本文应用非靶向代谢组学阐释了在不同生长条件下,诱导剂类型和浓度对工程菌代谢指纹谱图的影响。


简介


制药、农业以及加工制造业对特种化合物的巨大需求,一直是现代化学工业面临的巨大挑战之一。而现代化学工业需要在日益严格的监管审查情况下,不得不提出环境友好型的生产方法。由合成生物学和科技驱动的生物技术方法被认为是有潜力能够提供必要的持续解决方案。合成生物学的核心是将“设计-构建测试框架1”应用于重新设计的天然生物系统内以实现目的。通过在微生物(例如大肠杆菌2和链霉菌属3)的“生物工厂”中插入和微调遗传信息,组装复杂的酶促途径以实现化学物质的快速和多样化生成。像异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Lac启动子)或四环素(Tet启动子)这样的诱导型细菌启动子,通常用于激活基因转录,开启工程化生物合成途径。然而,人们还未完全掌握这些诱导系统与整个细菌代谢组的相互作用,尤其是毒副作用方面的影响。


本研究的目的是研究不同增长条件下,如何应用非靶向代谢组学了解诱导剂类型和浓度对工程菌(含有IPTG诱导型红色荧光蛋白表达质粒pBbA1a-RFP的大肠杆菌DH5α)代谢指纹谱图的影响。这种表型信息有可能为上游基因调控提供参考,同时也可更好地定义该启动子在生化途径表达中的最有效用途。

 

为了研究由细菌中的启动子诱导引起的代谢变化,使用Thermo Scientific TM Q Exactive TM GC Orbitrap TM GC-MS /MS系统检测,并鉴定来自细胞外部代谢组(用过的培养基)的大量代谢物。该系统具备检测并定性复杂基质样品中代谢物必需的性能特点,即:高灵敏度(低至ppt水平)、宽线性范围(覆盖浓度广泛的代谢物)、高分辨率高质量精度(60,000 FWHM @ m / z 200,<2ppm)。


本研究使用的非靶向工作流程如下:随机排序分析生物样品及质控样,并且每隔五个样品分析由混合样品配制的质控样,确保分析过程无误,并且可以评估系统的稳定性。采集得到的数据经过解卷积、库检索得到初步的化合物ID,在样品组之间选择具有显著影响的化合物进行方差分析。流程同时使用低分辨NIST2017谱库以及Thermo ScientificTM OrbitrapTM GC-MS HRAM高分辨代谢物谱库(第一个基于GCMSEI的高分辨代谢物商用谱库)。高分辨代谢库同时覆盖初级和次级代谢产物,包含800余种代谢物及其对应的超过900个保留指数信息。GCMS分析过程中,正构烷烃混标(C7-C30)作为保留时间标记物,添加到所分析的样品中。


实验内容


生长条件


将来自甘油储备液的大肠杆菌DH5α 接种到LysogenyBroth(LB)琼脂平板上,随后接种到含有0.4%葡萄糖的
Terrific Broth(TB)或LB中,37℃下振荡孵育过夜。将培养物(1/100)接种到24孔培养板中的1mL新鲜发酵液中,生长至中期对数期后使用Hamilton®Multistar自动系统,在不同IPTG水平(25,50和100μM) 终浓度)下,37℃振荡培养24小时。

 

样品前处理及衍生化

 

孵育后,用1mL冷甲醇(-48℃)淬灭样品以停止细菌内的任何酶促作用,并在12,225 RCF下离心15分钟以从培养基中除去细胞碎片。然后使用0.45 μm注射过滤器过滤100 μL上清液,加入100 μL100 μg/mL D-葡萄糖和1-丙氨酸-d7的内标溶液后,在真空下干燥。在冻干的粉末中加入50 μL的20 mg/mL甲氧基胺/吡啶溶液,65℃下孵育40分钟,以使任何可能不稳定的酮基团甲氧基化。然后加入50 μLMSTFA+ 1%TMCS(N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺+ 1%三甲基氯硅烷),在65℃孵育40分钟,使任何不稳定的羟基和胺基团替换为TMS(三甲基甲硅烷基)部分,进行硅烷化反应。TMCS为反应催化剂以确保最佳目标化合物硅烷化反应充分。


GC-MS分析条件


样品通过Thermo ScientificTM Triplus TM RSHTM自动进样器注入到热分流/不分流进样口(280℃),使用Thermo ScientificTMTraceTM 1310GC系统和Thermo ScientificTM TraceGOLDTM TG5SilMS 30 m x 0.25 mm I.D. x 0.25 μm毛细管色谱柱(P/N26096-1425)进行色谱分离。每个样品总运行时间为33min。仪器参数的其他详细信息如表1和表2所示。

 

 

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非靶向代谢物检测与识别的数据处理流程


将锁定质量模式下全扫描数据导入到Thermo ScientificTMCompound DiscovererTM软件,进行非靶向化合物定性工作流程。该流程包括保留时间对齐、归一化以及统计分析(主成分分析和差异分析)。通过Thermo ScientificTM TraceFinderTM软件进行解卷积,并用前述提及的HRAM代谢物谱库完成化合物识别。此外,NIST 2017低分辨谱库可以用来进一步扩展推定代谢物的数量。

 

结果与讨论


在有无IPTG,以及各种浓度水平的IPTG诱导条件下,测定大肠杆菌培养基(LB和TB)代谢物的相对浓度。将包括这些样品和QC样品的原始数据导入到Compound Discoverer软件,根据处理方式(IPTG)和培养基(LB和TB)进行分组(图1)。Compound Discoverer软件中的峰对齐步骤,是为了补偿序列中组分保留时间的微小差异(图1)。

 

以峰面积500000为阈值,峰提取窗口为±5ppm进行提取,然后进行归一化来校正潜在的批次效应。为了识别类别差异,对数据进行主成分分析(PCA)(图2)。 此时,前两个主成分解释了数据集中54%的方差,其中PC1(30%)由两种培养基类型之间的差异支配,PC2(24%)由诱导和未诱导之间的差异决定。通过使用这种方法,PCA载荷图与空白培养基的比较可以鉴定样品类别之间不同的细菌代谢物。

 

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图1 IPTG诱导并在LB培养基中生长的大肠杆菌DH5α培养物的部分化合物峰对齐结果

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图2 PCA图(上)及载荷图(下)。特定椭圆内的数据点代表在TB或LB培养基中生长的大肠杆菌DH5α(蓝 - TB培养基对照,LB培养基对照)和在不同培养基条件下包含不同水平的pBbA1a-RFP(IPTG)载体后( 橙 – TB处理,LB处理)。 此外,分析了QC(n = 8,合并的样品)以测试仪器和方法性能。

 

PCA分析是无监督的统计学方法,其结果显示样品组完全分离。因此,接下来的三个数据处理步骤旨在寻找导致组差异的重要代谢物,也就是LB对照组与LB IPTG处理组的差异。我们将数据进行了ANOVA方差分析并通过Tukey显著性检验。Compound Discoverer软件中的火山图分析提供了可调的显著性P值和差异倍数(Fold Change)。软件通过对差异倍数的log2与P值的-log10转化绘制火山图,并从中识别出在组鉴别中重要且具有合适差异倍数的化合物(图3)。从火山图中以p<0.05、log2 差异倍数>1,挑选出212种化合物的2045离子,然后应用TraceFinder软件,进行谱库检索,对这些关键代谢物进行鉴定。

 

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图3 基于LB IPTG 100(绿色)和LB对照(红色)样品生成的火山图,图左右两侧显示了显着促成样品组差异的化合物。x轴表示两个样品组之间倍数变化的log2值,y轴表示调整后的ANOVA p值的-log10。 每个样品组中排名靠前的离子以蓝色突出显示。

 

应用Orbitrap-GC HRAM代谢物谱库进行化合物鉴定


非靶向GC-MS代谢组学研究的总体目标是检测和标记(鉴定)组间差异的代谢物。这通常通过将实测的质谱图与标准品自建数据库或单位分辨的商业谱库(例如NIST或Wiley)进行比较来实现。基于标准品自建库的未知物鉴定主要采用被大家广泛遵从的MSI(Metabolomic Standards Initiative)的最高水平对应的最低报告标准。将统计学上具有显著特征的化合物发送至TraceFinder软件并使用NIST 2017和Thermo Scientific Orbitrap GC-MS HRAM代谢组学谱库以及对应C10-C19正构烷烃的保留指数进行鉴定。该谱库是使用标品在GC-Orbitrap/MS上获得,包括约850个独特代谢物在EI源(70eV,6000分辨率)下的图谱。每张图谱包含保留指数、CAS号以及PubChem标识符。图4为甘氨酸三甲基甲硅烷基酯(glycine 3TMS)的匹配实例。

 

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图4.使用Thermo Scientific Orbitrap GC-MS HRAM代谢组学库鉴定glycine 3TMS。

正反匹配结合精确质量信息增加了化合物鉴定的可信度。

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图5.TraceFinder软件解卷积插件中代谢物鉴定的实例,

a为化合物列表,b为检索结果,c为质谱图对比,d为GABA 3TMS的解卷积结果。

 

以此类推,从ANOVA和火山图分析中可靠地鉴定了39种重要代谢物,并计算了它们在每个样品中的相应峰面积倍数变化(表3)。在每个IPTG浓度下鉴定的每种代谢物的倍数变化都在彼此变化的一倍单位内。 这表明在使用更高量的IPTG时观察到相同代谢物的变化最小。因此,至少在代谢水平上,应鼓励保守使用IPTG,以降低成本和其对环境的影响。 在实验设计中优化IPTG水平是合乎逻辑且重要的一步,这种方法已经被证明在萜烯和蛋白质的生产中是有效的。然而,这并不是完全公认的做法,因为研究人员使用过量的IPTG可以节省时间。 但是,由于IPTG目前每100克的成本高达400美元,因此当方法转移到工业规模时,开发一种精确的诱导剂使用方法变得更加重要。

 

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表3.检测到的显著促成LB IPTG 25,LB IPTG 50和LB IPTG 100的组差异代谢物的倍数变化表。绿色至红色梯度表示与空白培养基相比相关代谢物的倍数变化。 在LB培养基对照和每种IPTG处理的样品之间进行所有比较(例如,与LB培养基对照相比,腐胺在LB IPTG 25样品中上调5倍)。 表格里的颜色和强度用于表示倍数变化的变化。 在下面的例子中,红色表示上调的代谢物,绿色表示下调的代谢物。

 

假设通过差异倍数大于2来代表实际差异丰度,而不是系统噪声,结果表明IPTG水平的增加促进了糖(海藻糖,山梨糖,葡萄糖和甘露糖)的消耗并且降低了几种氨基酸(丝氨酸,精氨酸,脯氨酸和酪氨酸)的浓度水平。这些变化可能反映了IPTG对质粒的诱导和活化,并且一旦开启,就会产生红色荧光蛋白。需要糖代谢来为蛋白质生物合成提供能量,而氨基酸的减少则突出了对原料的需求。有趣的是,GABA(γ-氨基丁酸)显示出明显的四倍减少,这可能表明细菌将其用作替代能源。GABA可通过GABA分流途径转化为琥珀酸进入TCA循环。琥珀酸本身在质粒诱导时也显示出两倍的降低,但是富马酸(TCA循环中来自琥珀酸的代谢物)显示出5倍的增加。 在W3110大肠杆菌菌株中也观察到IPTG诱导后琥珀酸的减少,其中在蛋白质生产期间观察到类似的基本营养变化。能量循环中的这种瓶颈可能是由于富马酸水合酶缺乏将富马酸转化为苹果酸的能力所致。识别这种潜在的速率限制步骤是后续设计-构建-测试周期的重要环节,以便产生更有效
的反应途径。3-羟基丁酸也显示出高倍数变化,这表明TCA循环代谢流出现问题。 在大肠杆菌中,该酮体可以转化为acetoacetyl-CoA,其最终被修饰成acetyl-CoA,acetyl-CoA是糖酵解中脂质代谢产生能量的重要代谢物。 除此之外,与LB培养基对照相比,在IPTG处理的样品中观察到腐胺水平增加(表3)。来自大肠杆菌重组表达系统的腐胺的印证了从BL21(DE3)菌株观察到的结果。腐胺是一种多胺,它是由活细胞和死细胞中蛋白质来源的氨基酸分解产生的。 代谢物的上调可能表明通过降解其他蛋白质来获得RFP产生的氨基酸的需求增加。与激活转运蛋白相比,以这种方式循环利用化合物是获得必需原料的有效途径。


结论

 

该研究获得的数据清楚地显示了由IPTG诱导和随后的蛋白质产生引起的大肠杆菌细胞的代谢指纹上的显着变化。然而,重要的是要注意,由于该研究属原理论证,难以确定诱导或蛋白质产生以及随后的细胞外运输是否导致观察到相关的代谢变化。 需要更大的二次实验来完全验证和确认生物学发现。


• 采用非靶向分析策略鉴定出39种显着代谢差异物,这些细胞外代谢物在LB培养基组、不同水平的IPTG诱导组、和相应的对照组之间,显示出统计学上的显着性差异。
• 通过使用包含保留指数信息的HRAM高分辨代谢组学数据库简化了代谢物鉴定流程,显着提高了化合物鉴定的可信度,而化合物鉴定是代谢组学中最关键的步骤之一。
• Compound Discoverer软件和TraceFinder软件简化了数据查询步骤,验证了定性和定量信息,增加了结果的可信度。

 

总之,使用GC-Orbitrap/MS系统以高分辨率模式在全扫描模式下操作,可以非常可靠地检测和识别代谢物,并且能够区分不同的生物样品组。

 

参考文献
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仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。 

@dongdan 

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‎09-10-2022 09:00 AM
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