BioPharma Finder 4.1软件对宿主细胞残留蛋白进行全面的鉴定和非标记定量

[技术专家]

BioPharma Finder软件是Thermo用于生物药表征的一站式分析软件，可以用于生物药分子量、肽图、二硫键、寡核苷酸和Top-down的分析。在今年推出的BioPharma Finder 4.1版本中，增加了宿主细胞残留蛋白（HCP）和mRNA的分析功能。

BioPharma Finder 4.1具有HCP分析功能后，我们可以使用同一个软件进行生物药的表征和HCP的分析，不再需要使用其他的搜库软件（如Proteome Discoverer 、MaxQuant）分析HCP的数据。

｜GUIDE｜

本期小编分享一篇基于Q Exactive plus高分辨质谱仪和BioPharma Finder 4.1软件对下游纯化工艺(downstream purification process, DSP)不同阶段产品的HCPs进行分析的应用方案：Comprehensive identification and label-free quantitation of host cell protein contaminants using BioPharma Finder 4.1 software.

宿主细胞残留蛋白是生物药生产过程中来自宿主表达系统的低含量的工艺相关杂质，可能影响药物的质量、安全性或稳定性。ICH Q11将HCPs确立为生物药的关键质量属性，法规指南要求必须对HCPs含量进行监测和管理，使其达到可接受的水平。虽然没有指出准确的含量，但在工业界中目标为在最终产品中总HCPs含量要小于100 ppm。因此，必须设计下游纯化工艺来实现这些杂质的强力去除。在细胞培养收获后大部分纯化单克隆抗体的过程涉及蛋白A亲和层析法。随后，包括两个或三个步骤（如阴离子交换、阳离子交换和疏水相互作用色谱）进一步纯化产品和去除HCPs。

在本研究中，基于高分辨质谱对内部生产的IgG1单抗在蛋白A纯化的不同阶段的样品进行了HCPs鉴定和非标记定量分析，用于评价下游纯化的效率，最大化蛋白A纯化HCPs的能力。DSP-Stage1样品来自于早期的Protein A纯化循环，DSP-Stage2的样品来自于Protein A纯化生命周期的末尾。实验过程大致为经蛋白A纯化的样品DSP-Stage1和DSP-Stage2分别用胰蛋白酶酶切成肽段，用Acclaim VANQUISH C18 column (2.2 µm, 2.1 mm x 250 mm)反相色谱柱进行分离，再经Q Exactive Plus高分辨质谱检测，采集的数据用BioPharma Finder 4.1进行肽图和HCP的分析，实验流程如下图所示。

图1. 宿主细胞残留蛋白分析和非标记定量的实验流程（点击查看大图）

BioPharma Finder 4.1使用Comet对MS/MS的数据进行Chinese hamster database (Chinese hamster Cricetulus griseus_uniprot-proteome_UP000001075)数据库检索从而鉴定HCPs。BioPharma Finder 4.1鉴定的HCPs的结果以3个面板呈现：

a) 宿主细胞残留蛋白定量结果；

b) 组分列表中用蓝色高亮显示的肽段用于非标记定量（强度最高的3个肽段，Top 3）；

c) 宿主细胞残留蛋白相对定量柱状图，如下图所示。

BioPharma Finder 4.1可视化展示，结果方便查看和比较。

图2. BioPharma Finder分析HCP定量流程（点击查看大图）

BioPharma Finder 4.1对Q Exactive Plus 高分辨质谱采集的DSP-Stage1和DSP-Stage2数据进行分析，在软件默认条件下（No filters）一共鉴定到124个HCPs；

若按Filter 1（鉴定到的蛋白至少包含2条肽段）进行筛选，鉴定到37个HCPs；

若按Filter 2（鉴定到的蛋白至少包含2条特异性肽段）进行筛选，鉴定到23个HCPs；

若按Filter 3（鉴定到的蛋白至少包含2条特异性肽段，且具有良好的二级谱图Structural resolution≤1.5）进行筛选，鉴定到19个HCPs；

若按Filter 4（鉴定到的蛋白至少需要包含3条特异性肽段，且具有良好的二级谱图Structural resolution≤1.5）进行筛选，鉴定到10个HCPs。

Average Structural resolution (ASR)是评价肽段碎片离子覆盖完整性的评分。ASR 1.0表示一个肽段序列的二级碎片离子完全覆盖，并显示在二级碎片离子覆盖图上。

图3.BioPharma Finder在默认条件下和自定义筛选条件下鉴定到HCPs的韦恩图（点击查看大图）

Q Exactive Plus鉴定到的肽段具有高质量精度的母离子（绝大部分肽段一级质量偏差小于4 ppm）并且有高质量的二级谱图，保证HCPs鉴定结果可信可靠。如下图a为上样量100 µg蛋白的总离子流图（灰色线显示），b为 HCP蛋白 lipoprotein lipase 3个特异性肽段提取离子图（红色线显示）。

图4. 100 µg 上样量DSP-Stage1样品总离子流图和lipoprotein lipase蛋白 Top3肽段提取离子图（点击查看大图）

DSP-Stage 1和DSP-Stage 2样品中lipoprotein lipase蛋白 Top3肽段二级谱图和碎片离子覆盖图如下图所示，虽然在两个样品中肽段强度不同，但都显示出了高质量的二级谱图。鉴定到的碎片离子的质量偏差小于5 ppm，鉴定结果非常可信。肽段碎片离子a-和b-离子用蓝色标注，y离子用红色标注。

图5. DSP-Stage 1和DSP-Stage 2中检测到的lipoprotein lipase蛋白Top 3肽段的二级谱图和相应的碎片离子覆盖图（点击查看大图）

按Filter 3规则筛选鉴定到的19个HCPs，HCPs的Accession、蛋白描述、蛋白分子量、肽段数目、打分、平均峰面积和含量详细信息见下表。

表1. 基于数据库检索鉴定到包含至少两个特异肽段的HCPs列表（点击查看大图）

在BioPharma Finder软件中，在两组样品中19个已鉴定HCPs的前三或前两种特异肽段的平均一级峰面积比如下图所示(详细信息见表1)。观察到大部分检测到的DSP-Stage2 / Stage1 HCPs (Top 3或 Top2肽段）平均一级峰面积比值接近0.5，这意味着超过120个蛋白A纯化循环与早期蛋白A纯化获得的洗出液相比，检测到的HCPs减少了一半。

而对于Nidogen-1蛋白，进一步的纯化循环对这个HCP没有任何影响，需要用其他的手段去除。使用非标记定量的方法，根据鉴定到每一个HCP蛋白和IgG1药物Top3肽段一级峰面积来计算每个HCP浓度（ppm 或ng/mg mAb）。根据非标记定量的结果可知，经过120个蛋白质A层析循环可以降低HCP含量，它们从非常低的浓度(< 10 ppm)到超过500 ppm，Elongation factor 2的浓度超过1000 ppm，这表明样品需要进一步的纯化。

图6. DSP-Stage2和DSP-Stage1样品的柱状对比图（点击查看大图）

本应用报告开发了一个宿主细胞残留蛋白数据分析的工作流程来评估下游纯化工艺过程中的蛋白清除效果。该方法利用已知浓度的蛋白质(原料药)进行非标记定量，可以很好地替代使用内标的绝对HCP定量，并且在很低的浓度下也可以获得相对浓度的良好评估。

Q Exactive Plus高分辨质谱可以使得样品获得高质量、高灵敏度的一级和二级谱图，保证HCPs深度覆盖并且可信。BioPharma Finder 4.1具有HCP分析新功能，可以直接对高分辨质谱采集的数据进行分析，鉴定和定量IgG1单抗中存在的低含量HCPs杂质，为HCP分析提供一整套的完整解决方案。

参考资料

1. Comprehensive identification and label-free quantitation of host cell protein contaminants using BioPharma Finder 4.1 software. Thermo application note 74109.

2. Comet open source tandem mass spectrometry (MS/MS) sequence database search engine. http://comet-ms.sourceforge.net/

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