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技术专家
Team TFS
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由LACC1编码的FAMIN(Fatty Acid Metabolism-Immunity Nexus)是一种和许多疾病相关的蛋白,高外显率突变,如C284R或I254V,可导致幼年特发性关节炎(JIA),成人Still综合症,麻风病或早发炎症性肠病等。小鼠的基因敲除实验结果也显示FAMIN活性降低会加重败血症和关节炎的程度,另有研究显示FAMIN会对线粒体功能的正常发挥和巨噬细胞的氧化磷酸化及糖酵解都产生影响。

 

英国阿登布鲁克医院和剑桥大学在相关方面做了一个多组学结合的实验并将结果总结发表在Cell杂志上,旨在研究FAMIN作为一个多功能嘌呤核苷酸代谢酶的作用,实验从不同角度,利用不同平台研究了嘌呤核苷酸的代谢及其对线粒体功能的影响。

 

1.png图:嘌呤核苷酸代谢通路

(点击查看大图)

 

现就代谢组学的部分进行详细介绍:

 

首先 :

 

将HepG2细胞进行FAMIN siRNA转染,并对细胞数目和耗氧量等指标进行监测,发现在FAMIN抑制后,细胞增殖减少,糖酵解和氧化磷酸化的速度都有不同程度的下降。将FAMIN抑制的 HepG2细胞分别和10ug重组人FAMIN254I或等量蛋白缓冲液(空白对照)在37℃的PBS中孵育1hr,将样本中的小分子代谢物用甲醇提取并进行LCMS分析,得到超过25,000个特征峰。

 

2.png图:正离子和负离子模式下检测到的离子m/z和丰度

(点击查看大图)

 

LCMS实验在Vanquish+Q Exactive Plus液质联用平台上进行,对于极性较高的水相代谢物,采用HILIC色谱柱进行液相分离,Orbitrap质谱的分辨率设置为70,000,完美分辨复杂的体系,同时高质量精度的数据确保在化学式匹配和化合物检索的时候得到准确结果,最大程度上减少了假阳性或假阴性情况的发生。

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对比FAMIN254I孵育的样本和空白对照,发现FAMIN254I孵育的提取物中3个特征峰有明显降低,4个升高,就像下面这张火山图展示的一样。

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确定这7个生物标志物的步骤如下:

 

1. 在鉴定的过程中,首先需要确定生物标志物的化学式,对于Orbitrap的数据来讲,这一步是通过精确质荷比和同位素精细结构结合来完成的(质量偏差不超过2ppm)

 

2. 然后将化学式同二级质谱信息结合,进行数据库的检索,得到化合物的结构信息,下图以adenosine为例,上半部分是实测数据中的二级质谱图,下半部分是mzCloud数据库里的信息,二者以镜像图的形式展示,清楚地体现了实测数据和数据库信息的匹配程度,并将匹配到的碎片结构进行标注。

5.png(点击查看大图)

 

此处检索的数据库为mzCloud(https://www.mzcloud.org/),mzCloud是规模庞大、信息丰富的高分辨谱图库,现包含超过18,500个化合物,并且这个数量还在不停增加,谱图的数量超过725万张,包括不同碎裂方式和碰撞能的信息,所有谱图全部为标准品的实测数据,是化合物鉴定的重要支持

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图:mzCloud界面展示(点击查看大图)

 

对于如此庞大的特征峰数量和理化性质各异的代谢物,实验者手动鉴定岂不是要做到头秃,不要担心,有强大的软件帮助我们自动进行数据处理。这个软件就是高分辨液质数据处理的利器——Compound Discoverer。

 

Compound Discoverer

 

Compound Discoverer软件可以完成从原始数据到最终结果的全流程工作,包括特征峰提取和对齐、化学式预测、化合物结构鉴定、代谢通路分析,以及代谢组学常用的主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)等,结果的呈现形式包括散点图、火山图、柱状图、箱式图、热图等,如果这些还不能满足你,别担心,用户还可以自编程将数据按照自己想要的方式展示或计算。


7.png图:Compound Discoverer结果展示示例(左→右:PCA散点图、火山图,S-plot,热图)

(点击查看大图)

 

 

本研究通过Compound Discoverer软件的自动峰提取、对齐和鉴定,得到差异代谢物a-c分别是adenosine、inosine和guanosine,为了进一步验证鉴定结果的准确性,将样本中三个化合物的提取离子流图同标准品进行比对,得到完全一致的色谱保留行为,故确定几个化合物鉴定的准确度,下图展示了化合物a和b 分别同adenosine和inosine标准品数据匹配的情况。

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同样的过程,对含量相对升高的化合物d-g进行鉴定,得到结果分别为hypoxanthine,guanine,pentose-phosphate, xanthine。至于究竟是哪种pentose-phosphate,同样采用同标准品的色谱峰比对的方法,并且采用TSQ Quantiva的SRM碎片比例来验证,确定结果为R1P,如下图。

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差异代谢物a-c在两组的峰面积在FAMIN254I组中有所降低,提示FAMIN可以分解胞内嘌呤核苷。

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同时,化合物d-f在FAMIN254I存在的情况下含量有所升高(g的量太低,不做展示),提示FAMIN在帮助核碱基和R1P合成。 

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化合物a-c均随重组FAMIN254I的剂量增加而峰面积降低,而其它核苷酸或核苷并未受FAMIN254I影响,提示FAMIN是作用于嘌呤核苷,将其生成对应的核碱基和R1P的酶。

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在拟靶向代谢组学的工作中,三重四极杆和Orbitrap高分辨质谱相结合,可以提供丰富的数据覆盖广度和超高的定量能力,本研究中采用TSQ Quantiva和Q Exactive Plus相结合,定位到同FAMIN作用相关的代谢物及其通路。在今年的ASMS,赛默飞推出了新一代Orbitrap Exploris 240,自带多种方法模板,同TSQ平台轻松进行方法无缝转换,操作简便,结合AcquireX功能,助力拟靶向代谢组学实验,将研究的覆盖广度和数据挖掘深度做到极致,有兴趣的老师请扫描以下二维码获得电子样本。


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参考文献:

Cader, M. Zaeem, et al. "FAMIN Is a Multifunctional Purine Enzyme Enabling the Purine Nucleotide Cycle." Cell 180.2 (2020): 278-295.

 

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