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技术专家
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在之前的文章中,咱们介绍了mRNA疫苗的质谱表征方法,“Orbitrap 高分辨质谱助力mRNA疫苗表征”,今天我们继续为大家详细拓展mRNA mapping的质谱表征应用。

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作为一种新的药物形式,mRNA在多个疾病领域具有显着的治疗潜力。进入细胞后,mRNA药物使用内源性细胞机制来表达预编程的蛋白质。这种表达的蛋白质可以实现多种目的,从促进特定的免疫反应到调节或恢复各种代谢过程等[1]。据WHO官网统计,全球目前正在临床试验阶段的mRNA药物已有几十种,应用方向覆盖传染性疾病、罕见病、肿瘤免疫学等。

 

与大多数生物治疗药物一样,序列分析也是mRNA药物的一个关键质量属性(CQA)。经典的检测方法如Sanger测序和二代测序 (NGS)等已被用于核酸链高通量及大规模的测序。然而在生物制品的表征分析中,往往需要正交方法以获取更全面的信息。对于核酸分析,LC-MS 作为Sanger和NGS的正交方法,与传统测序技术相比具有独特的优势:可直接对核酸样品进行分析(无需扩增等处理步骤);更高的检测灵敏度(直接检测低水平的序列变异体或修饰杂质(<1%丰度),且只需少量样品);更短的分析时间;可直接检测修饰核苷酸、自动识别修饰位点、种类和含量;避免传统测序过程中造成的碱基错误匹配[2]。

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由于核酸样品与蛋白样品的较大差异,其测序流程的前处理及LC/MS方法也大不相同。核酸仅有4个特定碱基,在组合形式上远小于蛋白序列,因此会有多个重复序列片段,需要酶解成较长的片段(通常大于15nt)以得到可用于序列覆盖的特征片段。此外核酸样品极不稳定,非常容易降解。基于此需求,我们在前处理上需要选择特异性较强的酶,并且减少酶解时间,得到具有漏切位点的较长片段。下图显示了优化后的核酸mapping分析流程,从前处理到液相分离、质谱检测、数据分析的一套完整方案。

3.png点击查看大图

 

No.01 # 前处理

 

Nuclease T1是一种真菌核酸内切酶,可切割鸟嘌呤残基后的单链RNA,具有较强的特异性,常用于核酸测序应用。但由于核酸内切酶效率很高,酶解时间较难控制,且传统的溶液酶解方法会使核酸酶残留在分析柱上造成污染。基于以上需求,赛默飞推出了一款前处理磁珠RNase T1 Mag Bulk Kit,将Nuclease T1酶固定在磁珠上,通过简单快速的磁铁吸附及可有效控制酶解时间,并去除溶液里的T1酶,该方式可以有效提高实验的重现性并降低酶的干扰(如下图)。

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有离线及在线两种方式可供选择:

a) 将样品配成200 μL体积放于eppendorf管中(如下图a所示),置于酶解仪中震荡孵育(37-50℃, 2000 rmp)5min ,通过磁铁吸附的方式将酶解上清与磁珠分离,再加入1%甲酸终止反应;

5.png图a:手动前处理示意图(点击查看大图)

 

b) 采用全自动磁珠纯化仪,反应、分离及纯化均可根据设置好的程序进行自动操作,适用于高通量前处理需求(图b)。

6.png图b: 全自动化在线前处理示意图(点击查看大图)

 

反应条件的优化:

a. 反应时间:酶解时间控制在5min 内,随着反应时间的增加(30min, 1h, 4h, overnight),序列覆盖度明显降低。对于修饰mRNA(如甲基化修饰),需要增加反应时间至30min.

b. 反应温度:37℃与50℃的结果类似


No.02 # 色谱柱

 

色谱分离采用一款专用于核酸分析的色谱柱,Thermo Scientific™ DNAPac™ RP,该色谱柱由球形宽孔径 4 µm 聚合树脂构成,可耐受极端 pH (0-14) 和温度 (5-110°C) 条件,在HPLC 和UHPLC仪器上均可使用,针对寡核苷酸可实现高分辨率和高通量,较小和极大的核酸链均可分辨(如下图A)。

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图A(点击查看大图)

 

 

图B显示DNAPac™ RP色谱柱的各类型号,mRNA mapping建议选用2.1*100 mm型号。

8.png图B(点击查看大图)


No.03 # 液相系统

 

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核酸样品吸附性强,而生物惰性液相系统吸附低;其次离子对试剂易腐蚀液相系统管路及接口,因此建议使用生物兼容的Vanquish UHPLC系统。

 

液相方法如下图:

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No.04 # 质谱

 

新一代Orbitrap Exploris系列产品具有体积小、性能高、操作简单等优势,扩展了Q Exactive系列质谱仪器的分析能力。如下图a所示,内置的AcquireX数据采集工作流程,为各种不同类型的应用设置参数模板,一键调用,可进行全面自动化的样品分析;且带有EASY IC离子源内标校正,保证仪器的高质量精度;更快的扫描速度可提高样品分析通量。图b显示mRNA mapping的方法模板:在peptide mode模式下,一级采用120,000分辨率,二级30,000分辨率;负离子扫描模式;stepped NCE 25,28,31 。该方法模板可一键调用,操作简便,且得到高质量的谱图。

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No.05 # 数据分析软件

 

 

Biopharma Finder软件可实现核酸样品自动化数据分析,如下图a所示,软件支持DNA及RNA样品序列管理,可自定义核酸骨架和可变修饰,操作简便;对二级谱图进行自动化注释和解析;寡核苷酸杂质定性和相对定量分析;多批次样品含量变化趋势比对。

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图b 展示定结果图表,列表里的每一行代表一条鉴定的核酸链,右上方对应的理论及实测二级图谱,将图谱里响应很低的峰放大,可以清楚的看到碎片离子的同位素峰,结果可信度高。

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Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基础上增加了长链mRNA mapping的功能,在数据处理方法中增加核酸酶模块,有常见的几种酶供选择,也可自定义添加酶。下图展示mapping分析结果,对于mRNA样品中每一条确证序列的片段,均可溯源详细信息,如在序列中的位置、一级和二级谱图、可信度、定量信息等。

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得益于Orbitrap仪器采集的高质量图谱,在核酸分析结果里几乎每一条链都可实现100%序列覆盖(Average Structural Resolution=1.0),这对于区分同分异构体非常有帮助。前面我们提到mRNA由4个特定碱基构成,在其酶解片段中出现同分异构是常见的现象,如下图,当仪器检测到足够多的碎片离子,可以确证同分异构的两条链里的每一个碱基,即可轻松区分两条分子量相同,序列不同的片段。

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对于长链RNA片段,如下图具有13个漏切位点,48个碱基长度的片段,也可鉴定到每一个碱基,得到高可信度结果。酶解片段越长,其序列特异性越强,对于RNaes T1酶解无法覆盖的短片段,也可采用mazF酶解得到的更长片段作为互补信息。

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案例分享:

编码新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)样品分析,首先用反相离子对色谱检测mRNA样品纯度,如下图a所示。

 

采用上述mRNA mapping分析平台,从前处理到液质表征分析,得到如下结果:图b显示mRNA样品经过RNase T1酶解后的总离子流图,由于部分酶解,得到的片段较长,具有高特异性;对于长度3900nt的mRNA样品,在该分析流程下,仅用RNase T1酶,即可获得98.5%序列覆盖度结果。

20.png图a

21.png图b: Spike Protein mRNA digested with T1(点击查看大图)

 

22.png图c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA(点击查看大图)

 

基于Orbitrap高分辨质谱核酸分析平台,可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能,为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。后续我们会持续更新mRNA表征相关内容,敬请关注。

 

参考文献:

[1]Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)

[2]Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500−8506 (2019)

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