cancel
Showing results for 
Search instead for 
Did you mean: 
技术专家
Team TFS
Team TFS

前言

 

质谱仪器作为一种质量检测仪器,被应用到各个学科领域中,尤其是在化学化工、环境能源、医药、生命及材料科学等领域发挥着重要作用。在常规质谱分析中,被分析物质首先被离子化,随后各种离子被引入真空中的质量分析器,在分析器中的电场或磁场作用下,离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异,因而造成时空上的分离,并由检测器依次检测出来。而在这种原理下,质谱仪测量的是离子的质荷比(m/z),而不是质量本身。

2.png


Challenge现有质谱仪在超大分子量检测中面临的挑战

 

利用质谱仪器对样品的分析过程中,样品的雾化过程十分关键。目前,常用的电喷雾技术原理是由John Fenn提出的电喷雾电离(ESI)技术,这一理论也获得了2002年的诺贝尔化学奖。通常对蛋白质这种大分子来说,ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群,群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布(例如z = 11,12....21,22...),人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z,进而求出实际的质量m的分布,也可以使用软件进行解卷积得到m分布。这种分析手段对于分析分子量较小(分子量在5万以下)、简单纯净的蛋白样品还是很有效的。

 

然而,在实际应用中对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升,分子结构越来越复杂,各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化,很宽的质量分布(可达上千Da)使得不同价态的峰群连接在一起。如图1所示,这种缺少电荷状态以及同位素峰的“死亡驼峰”,我们很难通过解卷积的形式进行分析。

3.png△图1:死亡驼峰示意图(点击查看大图)

 

并且,对于很多糖蛋白,分子量超过3、4万就出现峰群交叠,无法用解卷积软件来获得分子量的分布信息。因此,对于大生物分子的质谱分析,仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。在这种情况下,电荷检测质谱(CDMS)技术便成为了我们的“救命稻草”。

 

Q Exactive UHMR 高分辨质谱仪直接分析质谱技术DMT

 

电荷检测质谱(CDMS)通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数,进而计算获得离子质量m。

 

因此,相较于其他类型质谱,CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前,电荷检测质谱技术还没有现成的商品化仪器,只有能够自己开发质谱仪器硬件,或自己改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。而在今年的ASMS会议上,赛默飞公司重磅推出了直接分析质谱技术(DMT),并将其结合在了Orbitrap上,这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。

 

直接分析质谱技术

直接分析质谱技术其原理是:在Orbitrap中检测来自离子沿中心电极的中心轴旋转的轴向频率,进而确定离子的m/z信息;与此同时,来自外电极上的感应电荷振幅也会被检测,从而确定离子的电荷z的信息。

4.png

△图2:DMT技术原理图(点击查看大图)

 

直接分析质谱技术模式为 Orbitrap 质量分析仪增加了电荷检测功能,能够同时测量数百个单个离子的质荷比 (m/z) 和电荷数 (z)。这使得 Orbitrap 质量分析仪可以直接计算分析物的质量,而不需要根据 m/z 去卷积。根据 m/z 去卷积的方法依赖于测量结果中已分辨的电荷状态和/或同位素分辨的信号。直接分析质谱技术模式提高了分辨率,并且扩展了动态范围,提高了可获得的质量测量结果的上限,同时由于单个离子测量的灵敏度较高,可以从浓度明显较低的样品中采集到更有价值的数据。

 

Q Exactive UHMR(超高质量数范围)质谱仪

作为第一个商业化的电荷检测质谱仪,Q Exactive UHMR质谱仪不仅配备了直接分析质谱技术模式,而且还拥有适合大蛋白分析的性能参数(图3),例如扫描范围350-80000,四极杆隔离高达 m/z 25,000,还同时具备源内捕获, Source CID, HCD 等多种碎裂模式。

5.png△图3:Q Exactive UHMR质谱仪(点击查看大图)

 

基于此,我们提供了端到端的工作流程(图4),适用于数据采集、处理和解读以前难以分析的靶点。这大大降低了我们在实际使用过程中的难度。

6.png△图4:Q Exactive UHMR质谱仪配备直接分析质谱技术的端到端工作流程(点击查看大图)

 

Q Exactive UHMR质谱仪应用实例

 

01稳健地表征复杂的异质非变性蛋白质

高异质性蛋白质复合体的非变性质谱表征对于理解生物进程和开发下一代生物治疗药物至关重要。将传统的非变性质谱技术与仅测量 m/z 的集成测量结合使用时,由残余溶剂、离子加合物和翻译后修饰引起的电荷态分布的重叠某种程度上提高了复杂性,往往使得谱图难以解卷积。

 

直接分析质谱技术模式克服了这些挑战,能够对膜蛋白质、大型非共价蛋白质复合体、糖蛋白以及高度异质性的基于蛋白质和非蛋白质的治疗药物进行详细表征,并且提高了分辨率、灵敏度和动态范围。

 

如糖蛋白,它在许多生理机能和某些疾病的进展中发挥了关键作用。由于存在异质性,使用传统的、完整的、自上而下的质谱方法进行糖蛋白表征,这对研究人员来说是极其复杂的质谱挑战。此外,非变性质谱的糖型检测也受到空间分辨率和动态范围的限制。而直接分析质谱技术模式通过提高分辨率、拓展动态范围,开启了多种全新的可能,能够准确、高效、详细地鉴定各种糖型。

 

下图5所示就是对人胎球蛋白 A上的糖基化鉴定。由于人胎球蛋白 A有两个 N- 糖基化位点;最多七个 O- 糖基化位点;七个磷酸化位点;六个二硫键以及多种序列变体,使得直接质谱分析十分困难。而使用具备直接分析质谱技术模式的 Q Exactive UHMR质谱仪,则可以获得完整胎球蛋白 A 的更全面的糖型谱图(图5)。

7.png△图5:胎球蛋白 A 的在两种质谱模式下的综合表征(点击查看大图)

 

02以超高的灵敏度筛查和表征膜蛋白质

 

膜蛋白质及其复合体负责不同的生物机能,因此是特别常见的药物靶点,但由于其样品制备要求较高,其分析可能会充满挑战。通过并行单个离子测量,直接分析质谱技术模式提供了更高的灵敏度和分辨率,可以将样品稀释数百倍,以便使用微量的珍贵样品,单次运行即可实现样品表征。现在有可能以前所未有的灵敏度对非变性膜蛋白质进行筛选、杂质鉴定和同位素分辨表征,包括蛋白质变体和配体结合。

8.png△图6:DMT模式鉴定大肠杆菌水通道蛋白Aquaporin Z(AqpZ)(点击查看大图)

 

大肠杆菌水通道蛋白 Aquaporin Z(AqpZ) 是一个约为 99 kDa 的膜蛋白,由四个亚基组成。使用具备直接分析质谱技术模式的 Q Exactive UHMR质谱仪对 AqpZ 进行非变性质谱分析,在高能源内捕获设置下注入单体,揭示了 AqpZ 在单体和四聚体形式中的两种主要分布情况(上图)。将此谱图转换为质量域,这也显示了样品的杂质(中间)。用低分辨率进一步分析四聚体的峰值,结果表明出现了 28 Da变化的修饰(左下),或者高分辨率可以对质量域中的四聚体复合体蛋白变体进行同位素解析(右下)。

 

03复杂性蛋白质形态的表征

 

对于复杂生物治疗药物的分子,传统方法下我们无法对复杂的生物治疗药物进行全面的表征分析,或只能进行非常困难的流程。而依赖于直接分析质谱技术模式的 Q Exactive UHMR质谱仪,我们能够获得更宽的动态范围和更高的分辨率,并且做到同时测量m/z 和 z,因此可以观察到更多的蛋白质形式。

9.png△图7:依那西普结构图与质谱表征(点击查看大图)

 

依那西普/Etanercept是一种 Fc 融合蛋白(图7,左图),代表了一类新的治疗性生物药物。依那西普是一种肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂,可阻断导致类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的炎症和关节损伤的细胞因子瀑布级联。表征复杂的生物治疗药物面临着很多的分析挑战,可能需要进行复杂的样品处理和多个质谱实验。与传统的集成质谱方法相比,直接分析质谱技术模式通过直接测定电荷状态和质量,使复杂的生物治疗药物的表征越来越可靠,从而使得质量分布可视化的范围更为广泛,并且通过提高分辨率让这个蛋白的更多类型被呈现。(图7右图)


配备直接分析质谱技术的Q Exactive UHMR质谱仪应用范围

配备直接分析质谱技术的Q Exactive UHMR质谱仪在天然蛋白质、糖蛋白、病毒颗粒的成分和结构研究,抗原-抗体作用机理研究和疫苗研发方面有很大的未来市场空间:

10.png△图8:Exactive UHMR质谱仪应用范围

 

★1)实现复杂样品的精确分析,同时提供复杂样品中各蛋白分子的m/z与z等信息。

★2)测定糖蛋白及其它翻译后修饰造成的特定质量分布图,解释蛋白与翻译后修饰之间的关系,从而对糖蛋白相关的疾病诊断具有重要意义。

★3) 通研究DNA等生物大分子离子的电荷分布,以及质量与电荷的关联,推断这些大分子的结构,比如它的聚合程度等。

★4)在病毒研究中,可以用来确定病毒衣壳的蛋白复合体结构及其组装反应的过程

★5)在基因疗法研究和产品质控中,可以用来测定腺病毒载体的空壳率,检查载体内的基因完整度。

★6)灭活疫苗、病毒载体疫苗以及核酸疫苗产品的质量控制、效果评价

 

直接分析质谱技术在结构生物学和生物制药应用中的优势

★1)准确的直接质量测定,不需要根据 m/z 去卷积

★2)相对于传统的集成离子测量,分辨率最高可提高 20 倍

★3)仅需要较少的样品或浓度较低的样品

★4)可获得高达 80,000 m/z 的测量值和兆道尔顿 (MDa) 的质量测量值

 

如需合作转载本文,请文末留言。

 

@dongdan 

Version history
Last update:
Tuesday
Updated by:
Contributors