cancel
Showing results for 
Search instead for 
Did you mean: 
技术专家
Team TFS
Team TFS

关键词:
Q Exactive plus,靶标代谢组学,神经递质,氨基酸,生物胺,脂质,酰基肉碱

 

摘要


氨基酸、生物胺、酰基肉碱和脂类物质是体内重要的代谢物,涉及多种代谢途径,和细胞凋亡、氧化应激、免疫功能、信号转导等生物学功能密切相关,是生命科学和临床上研究的重点领域。本文建立了采用异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂进行衍生,408种内源性氨基酸、生物胺、酰基肉碱及脂类物质的靶标代谢组学分析方法。结果表明:41种氨基酸和生物胺类代谢物线性及重现性良好,标准曲线浓度为0.025~2000 μ mol范围内(依据体内浓度设定),R2>0.99;采用相对定量方法,酰基肉碱和脂类物质不同浓度QC 准确度接近真值。采用该方法,结合稳定同位素标记化合物作为内标,可排除不同生物基质样品带来的基质干扰,适用于血浆、血清、尿液、组织样本中的检测。


前言


生命科学研究充满着未知性和神秘感,吸引着各行各业的科学家们投入巨大精力不断进行探索。在生命科学奇妙世界里,基因、核酸、蛋白和小分子代谢产物构成了细胞生命活动的基本要素,以这些物质为基础的诸多Omics组学技术的发展,推动着生命科学研究的不断进展,近年来可谓精妙纷呈、大放异彩。其中,代谢组学作为“中心法则“的下游,提供的是生物学的终端信息,成为近年来广受关注的热点,是目前最炽手可热的研究方向之一[1-5]。脂类作为生物体内重要的物质之一,是构成生物膜双分子层的主要成分,具有多种生物学功能,与细胞凋亡、信号传导、疾病感染、免疫功能, 以及胎儿代谢缺陷都密切相关[6]。由华人学者首先提出的“脂质组学”这一概念[7],已经成为代谢组学的一个重要分支。


代谢组学及脂质组学从提出至今,已迅速发展成为系统生物学的一个重要组成部分,在代谢性疾病、阿尔兹海默症、糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝及肿瘤等疾病相关研究中发挥着重要作用[8-11]。


在依托质谱技术开展的代谢组学研究中,通常有两种主流的分析研究策略:立足于发现差异表达生物标记物的非靶向代谢组学分析(untargeted metabolomics);以及对预定科学假说进行定量验证或确证的靶标代谢组学(targeted metabolomics)[12-14]。通常意义上,一个完整流程的代谢组学研究大多始于基于高分辨质谱的非靶标代谢组学,而后演进到串联质谱的靶标代谢组学定量确证[15]。靶标代谢组学通常用于特定的代谢物有目标的进行精确定量分析,研究具有特定结构和生物学功能的代谢物。目前靶标代谢组学的研究中,串联四级杆质谱是最常用的技术之一。随着高分辨质谱技术的发展,采用高分辨质谱同时定性定量的方式显示出来独特的优势。以Q Exactive为代表的超高分辨质谱在灵敏度、线性范围、精密度等方面已能媲美串联四级杆质谱【16】,因此,高分辨质谱定量技术正日益成为包括靶向代谢组学在内的生物样品分析的研究热点 [17-18]。


本文拟采用Q Exactive Plus分析平台建立408种氨基酸、生物胺类、酰基肉碱以及脂类代谢物的定量分析方法,以期通过对关键代谢物的定量,帮助建立研究代谢物在不同人群中的变化规律的方法。

 

2. 实验部分


2.1 仪器、试剂与材料


2.1.1 Thermo ScientificTM Utimate U3000超高效液相色谱仪Thermo ScientificTM Q Exactive PlusTM超高分辨质谱仪
2.1.2乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈(色谱纯,美国Thermo Fisher公司);实验用水为Milli-Q去离子水;甲酸(色谱纯,Sigma);异硫氰酸苯酯(Sequencing Grade,Sigma),吡啶,乙酸铵,PBS缓冲液 均购于Sigma

 

2.2 化合物信息及溶液配制


所有代谢物及内标信息来源于AbsoluteIDQ® p400 HR Kit试剂盒,按照体内代谢物分布水平进行配制成8个浓度,标准曲线浓度为0.025~2000 μ mol不等。脂类及酰基肉碱代谢物采用同位素内标相对定量的方法,化合物信息见下表:

 

1.jpg

表1a:氨基酸、生物胺类、脂类化合物信息

2.jpg

表1b:41种氨基酸及生物胺类化合物信息

 

2.3 色谱条件:


2.3.1 LC-MS/MS色谱柱:Thermo p400 HR C18(2.6 µm, 50 x 2.1 mm);柱温:50℃;流动相:A:0.2%FA+H2O;B:0.2%FA+ACN,梯度洗脱程序(表2), 进样量:5 µL;

 

3.jpg

表2a. 氨基酸类和生物胺类分析梯度洗脱程序

 

2.3.2 LC-FIA-MS: 流动相:10mM乙酸铵,含0.1%甲酸甲醇溶液,梯度洗脱程序(表2), 进样量:5 µL;

4.jpg

 

2.4 质谱条件:


可加热电喷雾电离源(HESI),正离子扫描模式;扫描方式:Full Mass,分辨率70,000;扫描范围:100-1000 m/z;喷雾电压(+):3500V;离子传输管温度:300℃;离子源温度:550℃。


2.5 样品前处理


按照试剂盒推荐的样品处理流程,取10 μL标准曲线及尿液样品,加入10μL内标,采用异硫氰酸苯酯进行衍生化[19],具体流程见下图:

 

5.jpg

图2: 样品前处理流程

 

3. 实验结果与讨论


3.1 氨基酸及生物胺类物质


氨基酸及生物胺类物质是体内重要的代谢物,涉及多种代谢途径,和中枢系统、胰岛素抵抗、氧化应激、免疫系统等疾病密切相关,如多巴胺、多巴、五羟色胺等均为脑内重要的神经递质,一直是生命科学和临床上研究的重点领域。但这类氨基代谢物质的检测存在一定的难点,如极性较大,在反相色谱柱上难保留;亲水性色谱柱上色谱峰形较差,稳定性不好等问题。本文建立了异硫氰酸苯酯作为衍生化试剂进行衍生,稳定同位素标记化合物作为内标的方法,通过衍生化手段可以有效解决这些问题。


3.1.1 色谱图
采用衍生化处理后,41种代谢物的保留行为较好,可获得良好的色谱峰形,同时灵敏度也得到了提升,下图41种代谢物的提取离子流图。

 6.jpg

图3 41种小分子代谢物提取离子流图

 

3.1.2 线性范围
代谢组学研究中其中一个难点在于,代谢物在体内分布极广。除了对仪器的线性范围提出了极高的要求之外,对体内检测浓度范围的确定同样重要。本文中采用的线性范围通过大量样本的检测,确立下来41代谢物的线性范围,浓度见表3(注:因前处理过程中,样品稀释了60倍,进样的线性范围需除以60)。各代谢物在浓度范围内线性良好,线性相关系数r2均大于0.99,其中38个代谢物的RSD在0.1~4.9%之间,3个代谢物在6.5~7.4%之间。41种代谢物线性范围、线性相关系数、及RSD结果见表3,部分化合物标准曲线见图4。

 

7.jpg

表3 41种化合物的线性范围、相关系数及RSD

8.jpg

图4:亮氨酸标准曲线性良好,R2=0.9945

 

3.2 脂质分析


使用Q Exactive plus, 通过FIA(Flow Injection Analysis)的方式,可准确定性定量检测NIST 1950 215种脂类信息,包含酰基肉碱类、甘油磷脂类、鞘脂类、神经酰胺、甘油酯等,如图6所示,酰基肉碱类物质的QC准确度在90~110%之间,符合生物样品定量分析的需求。本方法,适用于血浆、血清、尿液、组织样本中的检测,最多可检测到365种脂类成分,血浆中部分检测结果如图7所示。

 

9.jpg

图5:酰基肉碱类LC-FIA-MS色谱图

10.jpg

图6:酰基肉碱类QC 准确度

11.jpg

表4 NIST 1950标准血浆中可检测到的脂类信息

12.jpg

图7:血浆中PC、SM、DG、TG类检测结果

 

4. 总结


靶标代谢组学作为代谢组学组学的重要组成部分,可用于验证非靶标代谢组学提出的假说。代谢物的准确定量将使代谢组学研究更可靠,有助于更深入地研究疾病机制。随着Orbitrap技术的推出,高分辨率质谱技术经历了快速发展,超高分辨质谱的同时定性与定量能力已经跨越到一个新的高度。统一的分析平台更好地适应了非靶标代谢组学和靶标代谢组学研究的需求,可以将非靶标全组分与靶标代谢分析熔铸一体,为研究带来新的形态与思路。本文采用QExactive Plus建立了的41种内源性氨基酸和生物胺类,以及365种脂类代谢物的分析方法,结合稳定同位素标记化合物作为内标的方法,可排除不同生物基质样品带来的基质干扰,适用于血浆、血清、尿液、组织样本中的检测。


参考文献

1. Pablo Sierra Gonzalez, James O’Prey, Simone Cardaci, et al.Mannose impairs tumour growth and enhances chemotherapy. Nature volume 563, pages719–723 (2018) .
2. Grankvist N, Watrous JD, Lagerborg KA, et.al.Profiling the Metabolismof Human Cells by Deep 13C Labeling. Cell Chem Biol. 2018 Nov 15;25(11):1419-1427.e4. doi: 10.1016/j.chembiol.2018.09.004. Epub
2018 Sep 27.
3. Jonas Zierer, Matthew A. Jackson, Gabi Kastenmüller, et al.The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nature Genetics, 50, pages790–795 (2018)
4. Dyar KA, Lutter D, Artati A, et al.Atlas of Circadian Metabolism Reveals System-wide Coordination and Communication between Clocks. Cell. 2018 Sep 6;174(6):1571-1585.e11. doi: 10.1016/j.cell.2018.08.042.
5. Long T, Hicks M, Yu HC, et al. Whole-genome sequencing identifies common-to-rare variants associated with human blood metabolites. Nat Genet. 2017 Apr;49(4):568-578. doi: 10.1038/ng.3809. Epub 2017 Mar 6.
6. Vaz F M, Pras-Raves M, Bootsma A H, et al. J Inherit Metab Dis, 2015 ,38 : 41. Doi: 10.1007/s10545-014-9792-6
7. Han X L, Gross R W. J Lipid Res, 2003, 44 : 1071. Doi: 0.1194/jlr. R300004-JLR200
8. Li M, Feng B, Liang Y, et al. Anal Bioanal Chem, 2013, 405 : 6629. Doi: 10.1007/s00216-013-7109-5
9. Li M, Tong X, Lv P, et al. J Chromatogr A, 2014, 1372 : 110. Doi: 10.1016/j.chroma.2014.10.094
10.Tang W, Li M, Lu X, et al. Biomarkers, 2014, 19 : 505. Doi: 10.3109/1354750X.2014.943290.
11. Yang L, Cui X, Zhang N, et al. Anal Bioanal Chem, 2015, 407 : 5065. Doi: 10.1007/s00216-015-8484-x
12. Dunn WB, Broadhurst DI, Atherton HJ, et al. Systems levelstudies of mammalian metabolomes:the roles of mass spec-trometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy[J].Chem Soc Rev,2011,40(1 ):387-426.
13. Griffiths WJ,Koal T,Wang Y,et al. Targeted metabolomicsfor biomarker discovery [J]. Angew Chem Int Ed Engl,2010,49(32):5426-5445.
14. Beger, R.D., Dunn, W., Schmidt, M.A. et al. Metabolomics (2016) 12: 149. https://doi.org/10.1007/s11306-016-1094-6
15. 吴泽明, 江峥, 陈伟. 高分辨质谱技术视野下的细胞代谢组学研究策略 [J]. 生命的化学, 2014, 34(2):000221-224.
16. Juntuo Zhou, Huiying Liu, Yang Liu, et.al.Development and Evaluation of a Parallel Reaction Monitoring Strategy for Large-Scale Targeted Metabolomics Quantification. Anal. Chem. 2016, 88, 8, 4478-4486
17. Gallien S, Duriez E, Crone C, et al. Targeted proteomic quantification on quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Mol Cell Proteomics, 2012, 11: 1709-23
18. Di Yu, Lina Zhou, Qiuhui Xuan,et.al. Strategy for Comprehensive Identification of Acylcarnitines Based on Liquid Chromatography–High-Resolution Mass Spectrometry. Anal. Chem., 2018, 90 (9), pp 5712–5718, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b05471
19. Anastasia Kalli. Targeted Metabolomics Analysis of Type 2 Diabetes Serum Samples Using Mass Spectrometry and a Standardized Quantitative Method. Special Issues.Volume 37, Issue 7, pg 18–2.

 

仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。

 

@dongdan 

Version history
Last update:
‎09-08-2022 10:00 AM
Updated by:
Contributors