采用GC Orbitrap MS技术对复杂基质中潜在的芳香过敏原进行检测和定量

[技术专家]

关键词：香料、过敏原、高分辨GC-MS、精确质量数、线性、定量、GC Orbitrap、 Chromeleon CDS

目标：确定基于Orbitrap™的GC-MS技术在潜在芳香过敏原常规分析方面的适用性。

前言

芳香化学品是一种合成的或天然的有机物，广泛用于全球化妆品行业中以生产制造如个人护理或清洁用品的中间或最终消费品。这些化学物质中的某些可能会引起皮肤过敏，其使用受欧盟监管1。因此，欧洲禁止在化妆品中使用某些芳香化学品（如：苔黑醛、氯化苔黑醛），而其他化学品虽然允许使用，但受到安全浓度限制，当上述这些物质存在并超过安全阈值时应加以标示。目前，欧盟列出了化妆品中受监管的26种潜在过敏原，当在保湿剂等驻留型产品中含量超过0.001%或像洗发水这样的漂洗式清洁产品中含量超过0.01%时，则必须在产品上标注。此外，根据消费者科学安全委员会（SCCS）3 的建议，该名单中的潜在的过敏原化合物数量可能在未来增加到57种。生产商有责任重视这些潜在过敏原的浓度限值，并确保这些物质的存在得到合理标注。消费者对产品含量有知情权，以防发生可能的过敏反应。此外，这也有助于皮肤科医生判断患者引起反应的原因。 

因此，对这些潜在的芳香过敏化学品准确检测，识别和定量非常重要，并需要分析仪器能够满足这些要求。对存在数百种其他芳香成分的情况下，筛查和定量大量潜在的过敏原分析具有挑战性，如潜在过敏原的浓度范围和基质的复杂性。选择的分析方法是气相色谱串联质谱检测器（GC-MS），定量范围为2 - 100 mg/kg。为应对这些挑战，实验室使用GC-MS串联质谱，如GC-QQQ（三重四极杆）、GC-ToF，甚至是多种仪器方法串联，像官方的IFRA GC-MS方法一样。诸如GC-MS平台类的局限性在于SIM或MS/MS的采集方法配置繁琐，每种化合物的重要数据量（每种化合物有多个校准曲线和/或每个样品进行多次稀释），并且也限制了有效的动态范围且也缺乏识别信心。此外，SIM或MS/MS采集模式下生成的部分数据，在常规分析中比全扫采集更难维护，因为需要始终对齐和检查SIM或MS/MS窗口与化合物的实际保留时间。

在这项工作中，采用基于Orbitrap的气相色谱-质谱联用技术(GC-MS) 对57种潜在的芳香过敏原（共60种，包括同分异构体）进行了分析。利用无与伦比的高分辨率、线性动态范围和灵敏度，自信地检测和识别这些潜在的过敏原化合物，并在由低至高的浓度水平上以稳定的方式，及可能的复杂基质样品中的对化合物进行定量。

实验

样品

采用溶剂标准品和香料模型对Thermo Scientific™ Q Exactive™ GC Orbitrap™ GC-MS/MS系统的定量性能进行测试。使用在三甲基乙酸甲酯溶剂中配制的标准品对化合物的线性、系统灵敏度、峰面积重复性和定量重现性进行测试，该标准品包含了60种潜在过敏原，其线性范围为： 2、10、50、100、1000 mg/kg及1,4-对二溴苯和4,4 -联二溴苯两个内标（200 mg/kg）。潜在过敏原定量使用的是一个由39种成分且不含所有潜在过敏原组成的模拟香料，并在“低”（加标浓度从0.4 到 4 mg/kg不等）和“高”（加标浓度从20到190 mg/kg不等）两个水平上进行加标。

仪器及方法设置

通过Q Exactive GC 串接 Orbitrap 四极杆质谱仪与ThermoScientific™ TRACE™ 1310 GC 系统联接进行数据采集。通过 Thermo Scientific™ TriPlus™ RSH自动进样器来实现样品进样，并使用 Thermo Scientific™ TRACE GOLD™TG-1MS 30 m × 0.25 mm I.D. x 0.25 μm 的毛细管柱（P/N 26099 - 1420）进行色谱分离。

Q Exactive GC系统使用全氟三丁胺进行调谐和校准，实现小于 0.5 ppm的质量精度。系统在电子电离模式（EI）下运行，采用全扫和60000质量分辨率、半峰宽(FWHM)，测试m/z 200（表2）。

表1. GC 和进样器条件

表 2．质谱仪条件

数据处理

采用Thermo Scientific™ Chromeleon™ Chromatography Data System (CDS) 软件进行数据采集、处理及报告的生成。使用一个包含名称、预期保留时间和每个化合物至少三个精确质量数的数据库，为目标化合物创建一个变色龙识别和定量方法。

结果和讨论

本研究的目的是评估Q Exactive GC系统在香水样品中对潜在芳香过敏原识别和定量的性能。评估了各种分析参数，如化合物的色谱分辨率、在大浓度范围内的灵敏度和线性，质量精度和定量的重现性等，具体的实验结果如下所述。

色谱

每次进样的GC运行总时间为 37分钟。100 mg/kg混标和100mg/kg加标香水样品的色谱分析示例如图1 所示。使用表1中所述的GC条件，即使为同分异构体化合物也能实现卓越的色谱分离。β檀香醇/法呢醇在提取离子色谱图上观察到最低分辨率为0.94。总地来说，只有六对化合物在浓度为1000mg/kg时分辨率低于1.5。

图 1A. TICs显示了在溶剂标样中对60种芳香过敏原的色谱分离。对第一种（苯甲醛）和最后一种（香紫苏醇）洗脱过敏原进行了注释。以全扫描（EI）方式在60000分辨率下进行数据采集（FWHM在m/z 200）。

图 1B. TIC显示了60种芳香过敏原的色谱分离，两种样品的柱上浓度均为0.05 ng。对第一种（苯甲醛）和最后一种（香紫苏醇）洗脱过敏原进行了注释。以全扫描（EI）方式在60000分辨率下进行数据采集（FWHM在m/z 200）。

图 2. 香芹酮（顶图）和香豆素（底部图）在柱上0.01 ng时的色谱图。显示了定量离子的积分峰面积、所有离子（定量和两个确认离子）的XIC堆叠叠加，在2至1000 ppm上响应（R2和%RSD残差）的线性和扣背景质谱图。以60,000分辨率（FWHM，m / z 200）全扫描方式进行数据采集。峰值保留时间（RT）及峰面积计算（面积）如注释所示。

此外，利用高分辨率和精确质量数信息获得的选择性示例如图4所示，由图可以看出铃兰醛可以从基质（香水）共流出组分丁基化羟基甲苯（BHT）中分离出来。

图4显示了该浓度水平下的共流出示例。在5 mg/kg水平下，检测到的所有化合物的离子比率均在所有浓度校准曲线的平均离子比率的15%范围内，确证了化合物的定性结果。

图 3. 在香水样品中新铃兰醛1（柱上5 ng）和戊基肉桂醛进行解卷积。戊基肉桂醛和新铃兰醛1两个质量数的提取离子色谱图（XIC）及TIC图如图所示。以60,000分辨率（FWHM，m/z 200）全扫描模式进行数据采集

图4. 香水样品中铃兰醛（柱上5 ng）和BHT的共出峰干扰可通过质谱解卷积来解决。BHT和铃兰醛的质量数的TIC图以及提取离子色谱图（XIC）如图所示。以60,000分辨率（FWHM，m/z 200）全扫描模式下进行数据采集。

Orbitrap 检测器的可重复性和线性

使用溶剂校准标样在2 ~1000 mg/kg（或柱上0.01至5 ng）的浓度范围内对潜在过敏原的检测器线性进行评估，各浓度水平注入两次，同时需要考虑到（1,4-二溴苯和4,4'-二溴联苯）两种内标化合物的响应。一周后重复相同的实验以测试该方法的稳定性，实验的结果如图5所示。

对于任何分析平台来说，将相同样品两次注入获得一致的峰面积是非常重要的，因为这将影响定量的准确性。如图6所示，对于1,4-二溴苯（内标）来说，得到了卓越的峰面积重现性。

图 5. 浓度范围在2 ~ 1000 ppm（柱上0.01 ~ 5 ng）内过敏原的校准曲线测定系数（R2）。每个校准水平在第1周和第2周，n = 2次重复注入溶剂标样获得的数据。

图 6. 在n = 16次进样（包括校准标样和基质香水样品）的1,4-二溴苯的峰面积重复性。计算 %RSD < 3.5%，定量和确认提取离子色谱图及EI质谱图如图所示。

潜在过敏原定量

对60种目标潜在过敏原进行Q Exactive GC 系统的定量性能进行测试。计算的校准曲线浓度范围为2 - 1000 mg/kg（或柱上0.01至5 ng）。潜在过敏原在“低浓度”“高浓度”香水样品的两个不同周上进行定量（图7）。

在“低浓度”样品中，57%的潜在过敏原被定量，误差小于20%（根据理论峰值来计算）。在“高浓度”样品情况下，95%的潜在过敏原低于这20%的限值，平均误差为7%。

高质量精度

除了定量能力之外，在所有标准曲线点及“低浓度”和“高浓度”香水样品中对潜在过敏原的测量质量准确度进行评估。为避免对潜在过敏原的错误识别（可能导致假阳性或假阴性结果），取得准确的质量信息至关重要。

对所有目标化合物而言，无论浓度高低多少，质量偏差均< 1.5 ppm。如图8中所示，对60种潜在过敏原n = 8次注入进行了证明。

图 7. 在“低”（A）和“高”（B）香水样品中对60种过敏原进行定量，显示了定量结果的重现性。蓝色和红色线分别表示在两个不同周内取得的数据。

图 8. 在10 ppm（柱上0.05 ng）和0.1 ppm（柱上0.0005ng）浓度水平下对54种化合物连续进样8次（n = 8）的平均值来对质量准确度（ppm）进行评估。百分之九十的过敏原都包括在箱形图中

结论

• 该研究结果表明，Q Exactive GC系统能够成功应用在潜在芳香过敏原的定量上。
• 与GC-MS-SIM或GC-QQQ相比，Q Exactive GC系统的全扫描高分辨、精确质量数采集的方法设置和数据分析更简单，且在高分辨率下更有助于那些可能会被添加到化妆品列表中的潜在过敏原的新化合物检测的追溯。
• 卓越的灵敏度、高质量精度、及 > 5个数量级的宽动态范围，确保了目标化合物检测、定性和定量的可靠性，从而降低假阳/阴的风险，尤其是在许多共流出组分的复杂芳香基质中，如香水。
• 由于与目前GC- MS 官方IFRA方法相比，每种化合物的校准曲线更少，每个样品的稀释度更低，因此如本研究所示，Q Exactive GC系统技术具有强大的分析性能极大地节省了实验室时间。

参考文献
1. Regulation (EC) No 1223/2009 of the European Parliament and of the Council of 30 November 2009 on cosmetic products of importance for the EEA (Official Journal of the European Union L 42/59, 22 December 2009).
2. EU: Annex III of EU Cosmetic Regulation 1223/2009 of the European Parliament and of the Council of 30 November 2009 on cosmetic products.
3. Scientific Committee on Consumers Safety, Opinion on Fragrance allergens in cosmetic products, SCCS/1459/11, 15th plenary meeting, 26-27 June 2012.
4. Chaintreau, A.; Joulain, D.; Marin, C.; Schmidt, C.O.; Vey, M. GC/MS quantitation of fragrance compounds suspected to cause skin reactions. J Agric Food Chem. 2003, 51, 6398–403.
5. The International Fragrance Association Analytical Working Group, Analytical method to quantify 57 suspected allergens (and isomers) in ready-to-inject fragrance materials by gas chromatography and mass spectrometry, IFRA Analytical guideline, November 2016.