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今日看点

 

在之前的文章中我们系统介绍了以Orbitrap为代表的质谱技术在疫苗研发和质量评价中的应用。本文我们将详细介绍Orbitrap如何助力新冠疫苗质量评价。

 

到目前为止,我国共五条主要新冠疫苗路线:灭活病毒新冠疫苗(中国生物、科兴中维等)、腺病毒载体新冠疫苗(康希诺等)、核酸类新冠疫苗(复兴医药、苏州艾博等)、亚单位新冠疫苗(智飞生物等)和减毒活疫苗,结构示意图如图1所示。

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图1 五种新冠疫苗结构示意图(点击查看大图)

 

 

其中,灭活病毒新冠疫苗组成最为复杂(图2),不仅包括主要抗原S蛋白,还包括其它结构蛋白(M、N、E),非结构蛋白、宿主蛋白和培养基蛋白等。

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图2 灭活病毒新冠疫苗生产流程(点击查看大图)

 

 

以mRNA为代表的核酸类新冠疫苗通常包含脂质载体(LNP)和mRNA两个组成部分。LNP通常由四种脂质组成,包括胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、可电离脂质(如,1、2-二亚油酸-3-二甲氨基丙胺MC3)和PEG化脂质。以Moderna为代表的mRNA疫苗生产企业以CAD为检测器用于LNP的质量控制,以Orbitrap质谱为检测器用于mRNA的质量评价,如加帽率、加尾和mapping(点击了解更多详情)。

 

无论是减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒载体疫苗还是亚单位疫苗,都包含新冠病毒的主要抗原—S蛋白。S蛋白的含量与疫苗的有效性息息相关,因此疫苗中的S蛋白的含量测定极其重要。ELISA是定量分析复杂样品中目标蛋白的经典方法,但ELISA方法通用性较差,难以用于对比不同厂家疫苗目标抗原的含量。Nie等[1]发展了中和抗体法,用于定量分析新冠病毒中S蛋白,该方法十分有效但耗时较长,难以实现疫苗的快速、高通量检测。Long等[2]以Orbitrap为检测器,采用PRM检测模式,减少检测假阳性并提高检测灵敏度实现灭活病毒类新冠疫苗中S和N蛋白的含量测定。

 

NO. 1 ★ 灭活病毒新冠疫苗组成分析

 

以Proteome Discovery™为检索软件,检索human,SARS-Cov2和monkey为蛋白库,从灭活新冠病毒原液中检测出33种蛋白(图3)。包括S蛋白、M蛋白、N蛋白和其他非结构蛋白。结构蛋白E因为纯化过程中病毒的破碎(图4)及其本身含量较低,难以在未经富集的原液中用常规源检出。

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图3 灭活新冠病毒原液蛋白组成(点击查看大图)

 

4.jpg图4 灭活新冠病毒电镜图。黄颜色圆圈为完整病毒;红颜色圆圈为破损病毒(点击查看大图)

 

NO. 2 ★ S蛋白和N蛋白含量测定

 

S蛋白是灭活病毒/减活病毒/病毒载体/亚单位疫苗的主要抗原。N蛋白是灭活病毒/减活病毒中含量最高的结构蛋白。在SARS和MERS的研究中曾发现,N蛋白等非抗原蛋白引起的ADE效应,因此,监测N蛋白的含量可为减活病毒/灭活病毒新冠疫苗的安全性研究提供依据。

 

Orbitrap即使在高分辨率模式下(>12万)仍能具有高灵敏度以及长时间质量稳定性(外标法校正,1-2周校正一次,1 ppm),非常适合复杂体系中目标物质的定量分析。本文以Orbitrap为检测器,PRM模式分析,定量S和N蛋白(图5-6,表1-2)。

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图5 S蛋白定量(左上)和定性(右上)肽段,N蛋白定量(左下)和定性(右下)肽段(点击查看大图)

 

6.png图6 S定量分析肽段色谱质谱图(左上)和空白样品分析图(左下),N定量分析肽段色谱质谱图(右上)和空白样品分析图(右下)(点击查看大图)

 

表1 定量参数

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表2 9批次灭活病毒新冠疫苗中S、N蛋白含量及质量比例定量

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NO. 3 ★ Orbitrap方法与ELISA方法的对比

 

图7对比了9个批次原液中Lowry法测总蛋白、Orbitrap测S蛋白和ELISA法测S蛋白的结果。如图7所示,Orbitrap测得S蛋白含量随总蛋白含量的增减而变化,且前8批次中与ELISA结果一致。在批次9中,ELISA定量结果显著低于总蛋白变化趋势和Orbitrap测得趋势,经检查是基质差异部分抑制抗体与抗原结合所致。

 

因此,Orbitrap结果与ELISA相比具有更好的抗基质干扰能力、可同时检测多种蛋白以及对比不同来源的新冠疫苗,具有更强的通用性。

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图7 Lowry法测总蛋白、Orbitrap测S蛋白和ELISA测S蛋白对比(点击查看大图)

 

NO. 4 ★ PRM模式和MRM方法对比

 

如图8所示,以三重四极杆质谱为基础的MRM定量模式和以Orbitrap为检测器的PRM定量模式具有显著不同。由于PRM的高分辨率和二级离子全采集,在面对复杂基质时具有更强的抗干扰能力和更高的灵敏度(图9)。

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图8 MRM和PRM对比图(点击查看大图)

 

11.png图9 复杂基质中PRM和MRM检测图(点击查看大图)

 

本文总结

 

● Orbitrap作为一种超高分辨质谱,在疫苗的研发、质量评价和质量提升上均具有较强的应用前景。

 

● 以上仅仅是Orbitrap用于疫苗质量评价的一小部分数据,更多的研究实例我们将在后续报道中为您展示,敬请期待。

 

关键词:疫苗,高分辨质谱,定量,新冠,S蛋白,N蛋白

 

参考文献:

[1] J. Nie, Q. Li, J. Wu, C. Zhao, H. Hao, H. Liu, L. Zhang, L. Nie, H. Qin, M. Wang, Q. Lu, X. Li, Q. Sun, J. Liu, C. Fan, W. Huang, M. Xu, Y. Wang, Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus based assay, 2020.

 

[2] Z. Long, C. Wei, X. Dong, X. Li, H. Yang, H. Deng, X. Ma, S. Yin, Y. Qi, T. Bo, Simultaneous quantification of spike and nucleocapsid protein in inactivated COVID-19 vaccine bulk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography B 1181 (2021) 122884.

 

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@dongdan 

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