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技术专家
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关键词:基因毒性杂质,Q Exactive Focus

 

摘要


本文在赛默飞高分辨液质联用仪 Q Exactive Focus 上建立了药物盐酸普萘洛尔中的基因毒性杂质盐酸普萘洛尔醚化物的快速检测方法。实验采用了两种电离源 ESI和 APCI,使用 H-SIM( 高分辨选择离子监测 ) 扫描模式,结果显示杂质在其相应的浓度范围内线性关系良好(r2>0.99),APCI 的灵敏度优于 ESI。本方法对此类环氧化基因毒性杂质的残留检测具有指导意义。


引言


基因毒性杂质是指能直接或间接损害 DNA,导致基因突变或癌症的物质。它们可能是来源于原料药中的杂质,也可能来源于原料药合成工艺等。近年来,随着法规的不断健全,对基因毒性杂质的监管也越来越高。2006-2008 年为国际上药品基因毒性杂质研究指南出台和认知接受阶段,一些基因毒性杂质综述类文献阐述了其背景,2008 年开始有了针对特定药物品种基因毒性杂质的研究文献,而且直到 2016 年,呈现逐年递增的趋势。2018 年 3 月 15 日药监总局发布了关于《药物遗传毒性研究技术指导原则(2018 年第 50 号)》,对药物及其杂质的遗传毒性研究方法做了进一步补充和完善。基因毒性杂质研究,已经成为 eCTD 资料药学研究部分的重要组成部分。


基因毒性杂质较常规杂质限度要求更严格(见下表),常规分析方法无法满足灵敏度需求。本文采用赛默飞高分辨液质联用仪 Q Exactive Focus,针对药物盐酸普萘洛尔中的基因毒性杂质盐酸普萘洛尔醚化物建立了快速的检测方法,未曾有相关文献报告过,对此类环氧化基因毒性杂质的检测具有指导意义。

 

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2. 实验部分


2.1 仪器与试剂
Thermo Fisher Ultimate3000 超高效液相色谱仪
Thermo Fisher Q Exactive Focus 高分辨质谱仪
甲醇(色谱纯,美国 Thermo Fisher 公司);实验用水为 Milli-Q 去离子水;甲酸(色谱纯,美国 Thermo Fisher 公司),乙酸胺(上海安谱)


2.2 样品信息及溶液配制
2.2.1 样品及标准品信息
药品盐酸普萘洛尔一个,盐酸普萘洛尔醚化物标准品一个,结构如下图:

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2.2.2 精密称取盐酸普萘洛尔醚化物适量,用甲醇溶解使其浓度为 1 mg/mL。再用溶剂(甲醇:水 = 25:75)稀释得到浓度为 2000 、1600 、1000 、800 、400 、100 、50 、25 、10 、5 、2.5 、2 、1 、0.5 、0.25ng/mL 的标准曲线溶液,待测。精密称取盐酸普萘洛尔样品适量,用溶剂(甲醇:水 =25:75)溶解得到浓度为 2 mg/ML(2000ppm)的溶液,待测。

 

2.3 色谱条件

色谱柱:Thermo Scientific SyncronisTM C18(150*2.1 mm,3 μm; 97102-102130);
柱温:30℃;
进样量:10 µL;
流动相:A 水(含 0.2% 甲酸,5mM 乙酸胺),B 甲醇。
本文采用了两种电离方式分别建立检测方法,由于两种电离模式下干扰物不同,洗脱梯度做了微调,APCI 的梯度洗脱程序如表 1,ESI 的梯度洗脱程序如表 2。

 

表 1. APCI 模式下的梯度洗脱程序
Table 1. Gradient Elution Program For APCI

表 2. ESI 模式下的梯度洗脱程序
Table 2. Gradient Elution Program For ESI

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2.4 质谱条件
ESI:可加热电喷雾电离源(HESI),正离子模式;扫描方式:H-SIM;喷雾电压 (+): 3500;离子传输管温度:350℃;鞘气压力 45 arb;辅助气压力 15 arb;离子源温度:300℃;分辨率:70000(FWHM, m/z=200 Da)

 

APCI: 正 离 子 模 式; 扫 描 方 式:H-SIM;Discharge
Current:+ 5 µA;离子传输管温度:350℃;鞘气压力
45 arb;辅助气压力 15 arb;离子源温度:350℃;分辨率:70000(FWHM, m/z=200 Da)

 

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高分辨选择离子监测 H-SIM 高分辨定量通过四极杆对目标化合物进行选择性通过,然后将目标化合物送入Orbitrap 进行高分辨扫描。通过四极杆的筛选和过滤,可去除大量的干扰离子,使目标化合物更多的进入检测器,然后通过一级精确质量数的提取进行定量。


3. 实验结果与讨论


3.1 灵敏度测试
采用上述分析条件,盐酸普萘洛尔醚化物在正离子模式下可发现其准分子离子[M+H]+为m/z 209.0910(图 1)。由于Q Exactive Focus的超高分辨率,该实验采用H-SIM扫描模式就可获得高选择性而过滤掉其他干扰物, 待测物在13分钟的色谱洗脱时间内均可获得良好的色谱峰。图 2 为盐酸普萘洛尔醚化物 [M+H]+ 的选择离子流提取图,在 ESI 和 APCI 条件下,采用外标法,其 LOQ 分别为 2ppb 和 250ppt。

 

图 1. 盐酸普萘洛尔醚化物在 ESI 和 APCI 下的质谱图
Fig1. Mass Spectra of 3-(1-Naphthoxy)-1,2-epoxypropane

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图 2. 盐酸普萘洛尔醚化物在 ESI 和 APCI 下的色谱图
Fig2. EIC Chromatogram of 3-(1-Naphthoxy)-1,2-epoxypropane

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3.2 线性范围测试
采用上述分析条件及外标法,对盐酸普萘洛尔醚化物进行线性范围测试,在 ESI 和 APCI 条件下线性相关系数 r2均 ≥ 0.99,线性关系良好。ESI 电离方式下,线性范围为 2-2000ppb,APCI 电离方式下,线性范围为 0.25-1000ppb,其线性方程图见图 3,各浓度点的 Diff 值见表 3。

 

图 3. 线性方程图
Fig3.Linear Ranges, Linear equations and correlation coefficients

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表 3. 各浓度点的 Diff 值
Table 3. The Value of % Diff For every concentration

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3.3 样品测试
采用上述分析条件及外标法,对样品中的盐酸普萘洛尔醚化物进行了含量测定。经检测,在浓度为 2000 ppm的盐酸普萘洛尔溶液中,盐酸普萘洛尔醚化物的浓度为1.619ppb,该杂质在主药中的含量低于百万分之一。


3.4 结论
本文分别采用两种电离的 H-SIM 模式对基因毒性杂质盐酸普萘洛尔醚化物建立了快速的高分辨液质检测方法。结果显示在正离子条件下,ESI 和 APCI 均能获得良好的质谱响应,其线性范围达到三个数量级以上,线性关系良好。在该检测方法中,盐酸普萘洛尔醚化物在APCI 中的灵敏度优于 ESI。传统的三重四极杆质谱定量使用 MRM 扫描模式,需要优化碰撞能量等参数。而该实验方法快速简单,利用 Q Exactive Focus 的超高分辨率提高特异性,采用一级离子即可进行定量检测,对此类环氧化基因毒性杂质的检测具有指导意义。

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‎10-25-2022 06:16 PM
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