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技术专家
Team TFS
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能够使靶点从“不可成药性”变成“可成药性”!PROTAC技术作为一种全新的药物发现策略,越来越受人们的关注!

 

1. PROTAC技术优势

 

  1. 不依赖“占位驱动”,超越小分子可能实现的效果
  2. 用量小,催化剂量即可,毒副作用小
  3. 克服靶蛋白突变/过表达引起的耐药
  4. 不依赖于亲和力,可选择性高
  5. 清除蛋白堆积

 

同时,PROTAC也面临着一些亟待解决的问题,比如:E3连接酶及其配体的拓展、E3连接酶突变带来的耐药性、脱靶毒性等?

 

赛默飞作针对PROTAC新药开发,提供从早期筛选,到体外,体内药理药效验证的完整解决方案,在一定程度上解决了PROTAC面临的问题。

 

2. PROTAC分子的高通量筛选


“大音希声,大象无形”,赛默飞基于超高分辨质谱仪的“无通量”小分子药物筛选方案,实现超高通量的化合物库筛选,极大提高了拓展配体分子的选择性,具体思路如下:

 

  1. 对每个化合物创建质谱图,建立包含成千上万个化合物质谱图的数据库;
  2. 将所有化合物混合在一起,构建化合物pool;
  3. 将带有标签(比如HIS、磁珠等)的靶蛋白,加入化合物pool中,充分孵育;
  4. 将靶蛋白化合物混合液过柱纯化,比如镍柱,磁力架等;
  5. 清洗掉非特异性结合的化合物后,再把结合的化合物洗脱下来;
  6. 将洗脱液过质谱仪分析,对比质谱图数据库即可知与靶蛋白结合的化合物。

 

1.jpg
QE系列质谱仪

扫描速度达18 Hz,识别化合物数量增加 50%

分辨率高达 240,000

 

应用实例:

Accelerating the Throughput of Affinity Mass Spectrometry-Based Ligand Screening toward a G Protein-Coupled Receptor, Yan Lu, etc., Wenqing Shui, Anal. Chem. 2019, 91, 8162−8169

 

2.png
利用Thermo Q Exactive HF超高通量筛选化合物的实验设计

(点击查看大图)

 

结论:

 

在本研究中,我们基于高分辨质谱,实现在一个Pool中筛选分析20000个化合物,极大提高了筛选通量。应用于发现A2AR配体时,该方法能够从高复杂性的化合物池中重复鉴定出高亲和力Hits。

使用该方法,我们期望可以进一步提高通量,在一个池中分析数十万甚至上百万个化合物。

 

基于该筛选方案,利用不同的E3连接酶突变体,进行多轮筛选,可解决E3连接酶突变带来的PROTAC分子耐药性问题!

 

3. PROTAC分子的靶点特异性分析

 

基于赛默飞Orbitrap系列的超高分辨质谱在蛋白组学中的应用,可轻易而举的解决小分子药物的靶点特异性分析的难题,能够最大程度减小PROTAC分子的脱靶毒性。


具体方案如下:

 

1 制备人源细胞裂解液,可预先敲出药靶基因,排除靶基因的干扰;

2 将偶联有生物素的小分子药物,加入到细胞裂解液中孵育;

3 过链霉亲和素亲和柱,清洗非特异性结合的蛋白;

4 加入洗脱液洗脱与小分子药物结合的蛋白;

5 将洗脱混合液,用Orbitap LC-MS做肽图分析,跟蛋白数据库对比,即可得知与药物结合的是什么蛋白。

 

3.jpg
Orbitrap Exploris™ 240质谱仪

 

4. PROTAC分子的细胞膜渗透率检测


PROTAC分子的分子量通常比常规的小分子化合物要大很多,能否有效穿透细胞膜,直接影响PROTAC药物的作用效果,因此准确评估PROTAC分子的细胞膜渗透率,对于PROTAC新药开发意义重大。

 

基于赛默飞Vanquish™ Duo UHPLC系统和Orbitrap Exploris™ 120质谱仪,能够极为精准的从细胞裂解液中,定量分析进入细胞内的PROTAC分子。思路如下:将PROTAC分子孵育细胞后,清洗分离细胞,制备细胞裂解液,将细胞裂解用UHPLC分离,然后用Orbitrap质谱仪进行定量分析,从而能够精准定量进入细胞内的PROTAC分子,核算出PROTAC分子的细胞膜渗透率。

 

4.pngVanquish™ Duo UHPLC 系统(左)

Orbitrap Exploris™ 120 质谱仪(右)

 

5. PROTAC分子的DMPK分析


在药物代谢分析方面,赛默飞基于串联质谱方法(LC-MS/MS)的解决方案,可提供卓越的选择性,具有良好的准确性、精准性和较宽的定量范围,具有分析通量高,多重分析能力强的特性,且方法开发时间短。

 

5.jpgQ Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪

(点击查看大图)

 

Thermo Scientific™ Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物。该LC-MS/MS系统将四极杆母离子选择性与高分辨率和准确质量数(HRAM)Orbitrap检测相结合,提供出色性能和多功能性。Q Exactive质谱仪特别适用于非目标或目标化合物筛查,也能够实现广泛的定性和定量应用,可广泛用于药物发现、代谢物鉴定、临床研究和法医毒理学。

 

此外在DMPK分析时的样品前处理阶段,Thermo Scientific™ Transcend™ II 系统将专有的 Thermo Scientific™ TurboFlow™ 在线样品制备技术和独有的 HPLC 多通路技术结合,提升数据质量、降低成本,并在不影响数据质量或灵敏度的情况下提高 LC/MS 通量。最大程度地减少了手动样品制备的需要,可直接将样品注入 LC-MS 系统——包括血浆、尿和其他复杂基质。

 

6.jpgThermo Scientific™ Transcend™Turboflow系统

(点击查看大图)


总之,PROTAC技术以其全新的药理学作用模式,及其所带来的诸多优势,展现出了在小分子药物开发领域极为广阔的应用前景,国内外诸多药企也都越来越多布局PROTAC技术。

 

赛默飞作为业内最大的综合性供应商,愿意以最完整的解决方案,最优质的产品质量,为各医药企业的新药研发助一臂之力!

 

 

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