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技术专家
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从2019年底由SARS-CoV-2(2型严重急性呼吸综合征冠状病毒)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)具有高传染性,该病已发展至全球大流行。

 

目前迫切需要开发抑制SARS-CoV-2感染或复制的疗法。SARS-CoV-2与其他冠状病毒有相似之处,所以目前主要通过对已用于其他适应症的药物库进行高通量筛选,鉴定出许多临床上认可的药物,可抑制高致病性冠状病毒的复制。然而却缺乏对SARS-CoV-2感染的治疗选择和细胞层面理解。


来自法兰克福大学医学病毒学研究所的Jindrich Cinatl教授和歌德大学医学院的Christian Münch教授团队发表的题为“SARS-CoV-2 infected host cell proteomics revealpotential therapy targets” 的最新论文。在本篇工作中,作者建立了感染SARS-CoV-2的Caco-212细胞模型,运用一种新颖的多重增强蛋白质动力学(multiplexed enhanced protein dynamicsme,mePROD)方法进行蛋白质组学分析。能够在高时间分辨率下确定转录组和蛋白质组的变化,加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标。

 

01 建立SARS-CoV-2感染的Caco-2细胞模型


对感染细胞进行蛋白质组学分析,该策略取决于是否有合适的允许病毒感染的细胞培养模型,以及对蛋白质进行时间感染特征分析的敏感蛋白质组学方法。为了探究潜在的抗病毒药物,作者建立了一个针对SARS-CoV-2高度兼容的细胞模型,在病毒感染24小时后就能迅速见到细胞致病作用(cytopathogeniceffect,CPE)(图1A)。

 

研究人员在病毒感染细胞后的2h、6h、10h和24h,分别用定量PCR技术测量上清液中的病毒RNA拷贝数,发现感染后SARS-CoV-2 RNA数量不断增加(图1B)。这表明病毒在细胞中经历了完整的复制周期,成功建立了功能性的SARS-CoV-2细胞培养模型,该模型可以用于研究细胞中SARS-CoV-2生命周期的不同步骤。

 

 

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图1. SARS-CoV-2 在细胞内快速复制模型。A, 病毒感染24小时后的细胞形态变化;B, 细胞上清液中病毒RNA拷贝数的增加。

(点击查看大图)

 

02 翻译抑制剂防止SARS-CoV-2病毒复制


为了确定SARS-CoV-2感染的时间分布,如图2A所示,作者用SARS-CoV-2单次感染Caco-2细胞后培养2-24小时,并通过mePROD蛋白质组学的方法,即联用新蛋白代谢标记(SILAC)和串联质量标签(TMT)两种标记方法,进行蛋白差异分析。

 

首先,将SARS CoV-2病毒与Caco-2细胞孵育一定时间,在收集样品前两小时,将培养基更换为重标SILAC培养基以标记新合成蛋白质;带有部分SILAC标记的蛋白酶切成肽段,经TMT11plex试剂标记后通过high-pH反相分级,最后借助Easy nLC 1200-Q Exactive HF高分辨质谱平台进行高通量蛋白质组学分析,用以表征宿主和病毒基因表达变化。

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图2:A, mePROD蛋白质组学分析流程(点击查看大图)

 

在三个重复中,我们分别定量到大约4,200种和7,000种蛋白质的相对翻译速率和相对蛋白质水平。主成分分析(PCA)表明,在感染6小时后实验组首次从对照组中分离出来;随着感染时间的延长两组之间的差异越来越大(图2B)。

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图2B, PCA分析结果(点击查看大图)

 

与SARS-CoV–1病毒类似,许多RNA病毒会降低宿主细胞的蛋白合成;但是实验组与对照组的总体翻译率变化不大,仅在感染10小时后最大降低了23%(图2C)。

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图2C, 不同时间点的整体翻译速率(N=3)(点击查看大图)

 

病毒蛋白表达的动力学是如何变化的呢?不同时间点病毒蛋白的定量结果显示,从转染后6小时开始,病毒蛋白的合成总量及合成速率均随时间持续增加(图2D),表明病毒基因的翻译效率或mRNA转录水平增加。

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图2D, 病毒蛋白随时间的变化(N=3)(点击查看大图)

 

那么病毒扩增与细胞中哪些代谢途径有关?

如何避免蛋白质合成发生重大变化的呢?

 

带着这些问题,作者将用对所有定量到的病毒蛋白的平均水平作为参照,计算宿主蛋白与其的距离,对最相关的前10%的蛋白进行网络分析。结果显示宿主细胞本身翻译模式的广泛重塑,可能解释了如何避免总体蛋白质合成发生重大变化(图2C,E)。

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图2E, 前10%蛋白的通路分析结果(点击查看大图)

 

抑制宿主翻译先前已被用作治疗SARS-CoV-1或MERS-CoV等多种冠状病毒感染性疾病。与其他病毒抑制宿主蛋白的合成从而增加病毒蛋白的合成不同,本文中的数据表明SARS-CoV–2仅引起宿主翻译能力的微小变化(图2C),作者推测SARS-CoV-2复制可能对翻译抑制更为敏感。作者还测试了两种翻译抑制剂,即环己酰亚胺(cycloheximide,翻译延伸抑制剂)和曲美汀(emetine,抑制40S核糖体蛋白S14)。如图3所示,在无毒浓度下,两个化合物均对SARS-CoV-2复制产生了显着抑制作用。两者合计,分析感染SARSCoV-2的细胞的跨膜组揭示了病毒和宿主蛋白反应的时间变化,从而导致发现翻译抑制剂是细胞中SARS-CoV-2复制的有效抑制剂。 8.jpg

图3. 环己酰亚胺和曲美汀对病毒复制的抑制作用(点击查看大图)

 

03 SARS-CoV-2感染对宿主细胞代谢途径的调节


接下来作者系统比较了病毒感染后的蛋白丰度以及SARS-CoV–2感染引起的细胞蛋白网络的变化(图4A)。

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图4. 代谢途径的重编程预示着治疗敏感度。

A, B, 所有实验组中的蛋白表达量聚类分析和反应路径分析(点击查看大图)

 

聚类分析的结果显示,感染过程中主要有两部分调节变化的蛋白:下调的部分主要包括胆固醇代谢相关的蛋白;上调的部分则主要与RNA修饰因子相关,例如剪接体成分和碳代谢等(图4B)。

 

如图4C和4D所示,作者尝试用PladeinolideB(剪接子抑制剂)和2-脱氧葡萄糖(2-DG,糖酵解相关的抑制剂)阻止SARS-CoV–2在Caco-2细胞中复制,对感染后蛋白质组进行定量分析,揭示了剪接体和糖酵解抑制剂是COVID-19的潜在治疗药物

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图4. C, D, pladeinolide B和2-DG对SARS-CoV-2复制的抑制作用。(点击查看大图)

 

04 蛋白质组动力学分析发现潜在的抗病毒靶标


为了探究与病毒蛋白共同增加的宿主蛋白,从而寻求潜在的SARS-CoV-2复制抑制剂,作者分析了与病毒蛋白变化趋势相似的蛋白(图5A)。

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图5. 核酸代谢相关的蛋白水平与病毒基因表达相关。A, 病毒蛋白随感染时间的变化(点击查看大图)

 

计算每种蛋白与所有病毒蛋白均值的距离,筛选FDR<0.01的所有宿主蛋白并进行功能互作网络分析和GO分析,如图5B所示,在数据中富集的代谢途径主要由不同的核酸代谢子途径组成。

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图5B 宿主蛋白与病毒蛋白关联的GO分析(点击查看大图)

 

基于此,作者测试核苷酸合成抑制剂对细胞中SARS-CoV-2复制的影响,高达10µM的布雷奎纳(brequinar,抑制双氢乳清酸脱氢酶(嘧啶从头合成相关酶))并不具有抗病毒的作用。相比之下,低浓度下的利巴韦林(ribavirine,抑制肌苷一磷酸脱氢酶(鸟嘌呤头合成相关酶))即可抑制SARS-CoV-2复制(图5C),这表明利巴韦林是可以进行进一步检测的候选药物

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图5C Ribavirin的抗病毒实验(点击查看大图)

 

此外,与蛋白质折叠相关的蛋白变化与病毒蛋白质较为一致,p97是AAA家族的六聚体ATPase酶,也是真核生物最丰富的蛋白之一,通过调节蛋白的稳定性来执行一系列生物学功能,参与膜融合、蛋白降解等过程。测试p97的小分子抑制剂NMS–873对SARS-CoV-2复制的影响。研究表明,NMS–873在低纳摩尔浓度下即可完全抑制SARS-CoV–2(图5D)。

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图5D NMS–873的抗病毒实验(点击查看大图)

 

总结

 

在本篇研究中,通过对SARS-CoV-2感染对宿主细胞进行定量蛋白质组分析,确定了由SARS-CoV-19感染调节的宿主细胞通路,并揭示了药物抑制病毒在人体细胞中复制的相关靶通路。感染过程中细胞功能发生了重大调整,SARS-CoV-2重塑了翻译、剪接、碳代谢和核酸代谢等重要细胞代谢途径,并对这些途径相关的小分子抑制剂进行测试。结果揭示了SARS-CoV-2的细胞感染情况,并鉴定出抑制病毒复制的药物,这些结果也将指导开发COVID-19的治疗方案。

 

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‎10-14-2022 02:40 PM
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