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技术专家
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疫苗是人类抵御疾病的重要武器,是成本最低、效果最好的疾病防御手段。从天花到鼠疫,从乙肝到新冠,疫苗帮助人们减少了一个又一个强传染性和高致病率疾病的发生。新型疾病的出现,呼吁新型疫苗的研发。新型疫苗的出现,提高了公众抵御疾病的能力。从疫苗研发到使用,需要经历选种、发酵/合成/转录、收获、纯化和成品等环节。

 

每个环节都离不开质量评价。疫苗的质量评价主要分生物评价和理化评价两种。生物评价长期以来作为疫苗主要评价方法,用于疫苗活性和毒性检测。但生物评价通常操作繁琐、耗时较长且需要大量动物。理化技术具有通用型强、通量高、准确度高和无需使用动物的优点,近年来被逐步用作为生物评价的补充。同时,理化技术还可用于探究疫苗活性和毒性高低的原因,为工艺的改进和新型疫苗的研究提供数据。虽然目前药典中疫苗的理化评价方法仍以滴定、紫外分光光度法、气相色谱和液相色谱等基础理化技术为主,但已有国内外研究机构和疫苗企业开始使用液相色谱质谱等先进理化技术为疫苗评价和改进提供新维度、新思路。

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液相色谱质谱按分辨率可分为低分辨质谱(单四极杆和三重四极杆)、高分辨质谱(Q-TOF)和超高分辨质谱(Orbitrap)。低分辨质谱的分辨率通常在5000以内,主要用于简单样品的定性。低分辨质谱中的三重四极杆质谱可用于样品的高通量定量分析。但随着样品复杂程度的增加以及人们对样品认识的不断加深,假阳性问题越来越困扰分析人员。为了减少样品假阳性的干扰,以高分辨和超高分辨质谱技术为基础的标准方法开始出现,如农业农村部第197-9-2019号国家标准。相对于低分辨质谱,高分辨质谱可提供更为准确的定性信息,减少假阳性。

 

面对复杂的蛋白和糖蛋白疫苗,以Orbitrap为代表的超高分辨质谱具有显著的优势[1,2]。

 

优势一:

Orbitrap在实现高分辨分析的同时不牺牲检测的灵敏度,可实现低丰度翻译后修饰肽段的检出,仅trypsin酶切即可实现高的氨基酸序列覆盖度。即使面对如蛋白质组学一样复杂的样品,Orbitrap仍能实现成千上万蛋白的同时鉴定。因此Orbitrap被认为是蛋白质组学分析的“金标准”,也是蛋白类药物表征的利器。

 

优势二:

Orbitrap具有超高稳定性,即使采用外标法、一周校正一次(中分辨质谱需6小时校正一次),仍可保持1-3ppm的一级质量偏差和超低的二级质量偏差,极大提高蛋白鉴定的准确度和可靠性。

 

优势三:

Orbitrap的PRM定量模式[3],可实现蛋白和多肽定量方法的快速建立且灵敏度可媲美高端三重四极杆质谱,无需复杂的碰撞电压优化过程。

 

优势四:

Orbitrap无需更换检测器,维护成本低。


重组类疫苗:HPV疫苗的表征与抗原蛋白含量测定

 

HPV疫苗用于预防因人乳头瘤病毒感染导致的癌前病变损伤,如宫颈癌。HPV疫苗由重组的人乳头瘤病毒的L1蛋白和佐剂制备而成。根据疫苗中L1蛋白的种类可分为2价HPV疫苗、4价HPV疫苗和9价HPV疫苗。其中,2价和4价HPV疫苗接种年龄范围最广,45岁前可接种。疫苗中抗原蛋白的含量与疫苗的活性直接相关。传统的抗原蛋白含量测定方法有Lowry法和ELISA法,Lowry法只能用于总蛋白的含量测定,难以实现单个抗原的含量测定。ELISA法可用于单个抗原的含量测定,但方法开发周期长且不适用于不同厂家产品的对比。

 

Ning等[4]以Orbitrap为基础实现2价HPV疫苗抗原16和18的定量肽段筛查。如图1所示,Orbitrap的高灵敏度可为目标肽段提供丰富的二级碎片,提高鉴定结果的可靠性、减少假阳性。

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图1 HPV 16和18的定量肽段二级质谱图(点击查看大图)


糖蛋白类疫苗:带状疱疹疫苗、水痘疫苗抗原


水痘(varicella chickenpox)和带状疱疹(herpes zoster)均为同一病原水痘-带状疱瘆病毒(varicella zoster virus,VZV )导致。原发性感染表现为水痘,感染后病毒常潜伏于中枢神经,当人体免疫力低下时,病毒被激活引发带状疱瘆。带状疱疹没有特殊药物可以治疗且伴随终生,疫苗是其防护的重要手段。带状疱疹疫苗和水痘疫苗是具有相同抗原蛋白,采用不同的佐剂达到预防不同疾病的作用。水痘-带状疱疹病毒是α疱疹病毒亚科水痘病毒属的成员。该病毒是直径在150〜200 nm之间圆形颗粒,由核衣壳、皮层和包膜三层组成。包膜主要由病毒糖蛋白与宿主细胞的脂膜组成,是病毒的主要免疫原所在,也是水痘疫苗和重组带状疱疹疫苗的主要抗原。


蛋白的糖基化(糖链的类型、糖基化位点:N糖和O糖)与蛋白的免疫识别和体内半衰期息息相关。单抗药物和蛋白质组学对糖基化的研究较为深入,疫苗的糖基化研究较少。以单抗体为例,常见的N-糖型主要有G0F、G1F和G1F-GlcNAc和G0F-GlcNAc等,如果出现OligoMan、Gal-a-1,3-Gal、NGNA、Xyl-1,2Guc-1,3等糖型,则会影响免疫原性和半衰期。另一方面,可用细胞工程及分子生物学技术,提高4-Fuc,GlcNAc bisecting,G2F,Hyper Sialyation(NANA)的含量,以增强ADCC,CDC和Anti-inflammatory等功能。疫苗虽然与单抗不同,但抗原的结构改变是否会响应抗原与佐剂的作用,以及抗原对免疫细胞的刺激和体内代谢,有待进一步研究。

 

以某厂家制备的重组水痘抗原蛋白为例,以荧光和Orbitrap为检测器,采集数据如下。无论是荧光检测器还是Orbitrap检测,均可检测到丰富的糖链信息。将Orbitrap检测结果用于糖链搜库,可从中检索到43种糖链。

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图2 水痘/带状疱疹疫苗蛋白糖链分析(点击查看大图)

 

 

与糖链同样重要的是糖基化位点,包括N糖基化位点和O糖基化位点。其中,N糖基化位点有专属性酶和较为成熟的研究。与N糖基化相比,由于O糖没有专属性酶且缺少经典的五糖核心结构,O糖结构的研究较为困难且容易受N糖肽和非糖肽信号的干扰。我们发展了前处理方法,去除N糖肽和非糖肽后,富集O糖肽,并以HCD&EThcD两种方式碎裂,提高O糖肽鉴定的可靠性。

 

通过对比去除N糖肽前后样品的修饰结果,确定N糖基化位点,如图3所示,以肽段KEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLK为例,去除N糖前的样品中未检测到明显的脱酰胺化,但可在该位点检测到不同类型的糖链。去除N糖后的多肽样品中,该位点脱酰胺化明显,未检测到明显糖肽信息,因此推测该位点为水痘/带状疱疹疫苗抗原蛋白的N糖基化位点。

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图3 去除N糖肽前后样品对比(点击查看大图)

 

 

去除丰富的N糖肽和响应较强的非糖肽,有利于提高O糖肽鉴定的可靠性。以肽段EDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNR为例,去除N糖肽前后均可检测到该糖肽,但去除N糖肽后,该糖肽中HexNAc(2)Hex(3)糖型响应更加明显,验证了该糖基化位点和糖型的可靠性。

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图4 典型O糖肽鉴定结果(点击查看大图)


亚单位疫苗:组分百日咳蛋白


组分百日咳疫苗是百白破疫苗、百白破-Hib四联疫苗、百白破-Hib-IPV五联疫苗和百白破-Hib-IPV-乙肝六联疫苗的重要组成部分。组分百日咳疫苗由超滤、柱层析等纯化工艺后收获的百日咳抗原成分PT、FHA和PRN按照一定比例制备而成。受限于超滤和柱层析分离能力,组分百日咳抗原中通常不仅含有PT、FHA和PRN,还存其它杂蛋白。以Orbitrap为技术平台分析组分PT样品,将所得数据用proteindiscovery处理,搜索百日咳菌谱库如图5所示,可从组分PT中鉴定到包括5种PT亚基在内的33种蛋白,其它蛋白包括FHA和BrkA等。

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图5 组分PT中蛋白种类的部分检测结果(点击查看大图)


核酸疫苗


寡核酸药物、小核酸药物受到医药行业广泛关注,尤其是2018年FDA批准了首款siRNA药物Onpattro(Patisiran)。2020年辉瑞突破核酸疫苗制备的瓶颈,推出首款核酸类疫苗——mRNA新冠疫苗,在疫苗行业(人用疫苗和动物疫苗)、制药行业和精准医疗行业引起巨大反响,成为多糖蛋白结合疫苗以来疫苗领域的又一重大突破。核酸疫苗的研究虽然还面临诸多挑战,但其易于多联多价和高的生物活性等优点吸引着大众。Thermofisher为核酸疫苗提供了多重分析手段,例如脂质体的分析利器——CAD,耐用皮实的LTQ和高通量的双三元液相结合实现核酸引物的快速分析,Orbitrap与Biopharma finder结合实现核酸精确分子量和核酸序列的确证。

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图6 Biopharma finder解析核酸序列(点击查看大图)


结语


Orbitrap作为一种超高分辨质谱,在氨基酸覆盖度、二硫键、蛋白分子量、糖链、糖基化位点鉴定和蛋白含量测定中具有显著优势。以上仅仅是Orbitrap解析疫苗的一小部分数据,更多的研究实例我们将在后续报道中为您展示,敬请期待。

 

关键词:疫苗,高分辨质谱,杂蛋白,糖链,糖基化,定量


参考文献:

[1] Q. Hu, R.J. Noll, H. Li, A. Makarov,M. Hardman, R. Graham Cooks, The Orbitrap: a new mass spectrometer,Journal of Mass Spectrometry 40(4) (2005) 430-443.

[2] R.A. Zubarev, A. Makarov, OrbitrapMass Spectrometry, Analytical Chemistry 85(11) (2013) 5288-5296.

[3] Y. Cong, L. Hu, Z. Zhang, Y. Gao, M.Dong, H. Qin, M. Ye, J. Gu, H. Zou, 胡良海。Analysisof therapeutic monoclonal antibody glycoforms by mass spectrometryfor pharmacokinetics study, Talanta 165 (2017) 664-670.

[4] T. Ning, S. Sun, J. Nie, M. li, W.Huang, X. Li, J. Cao, Y. Wang, Simultaneous quantification of majorcapsid protein of human papillomavirus 16 and human papillomavirus 18in multivalent human papillomavirus vaccines by liquidchromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A1619 (2020) 460962.


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