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技术专家
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本期放送


本期微课堂,我们来谈谈生物制药中绕不开的难点话题:宿主细胞残留蛋白分析。

 

什么是微课堂:


为了更好地服务中国生物制药企业接轨国际前沿法规与趋势,赛默飞开启名为: Leaders in BioPharmaceutical Characterization and Control的系列微课堂,为您带来最前沿的生物药表征与质控的最佳实践,一探生物药“创新”与“质量”的世界前沿。”


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Host Cell Proteins: Analyzing Impurity in Biopharmaceuticals


讲师介绍

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Amy Claydon博士是赛默飞生物制药客户解决方案中心高级应用科学家。在此之前,Amy担任克劳福德科学公司(Crawford Scientific)的技术顾问,为来自众多行业的分析人员开设了色谱和质谱多方面的课程。在获得博士学位之后,艾米还在利物浦大学(University of Liverpool)担任了近5年的博士后研究员,主要方向为使用稳定同位素标记和Orbitrap技术应用于蛋白质组学动态变化研究。

 

 

5min速览版:


为了方便您快速掌握微课堂咨询与要点信息,我们特地总结了5min速览版。当然,如果您想深入了解课程精髓,不错过原汁原味的国际专家分享,推荐您一定要观看完整版微课堂。

 

【看点】宿主细胞残留蛋白分析的难点及解决方案

 

通过工程细胞重组技术生产的生物制品,在宿主细胞表达目标蛋白的同时,宿主细胞本身的蛋白质也会部分表达,产生相关杂质。残留的宿主细胞蛋白质(HCP)可能导致患者出现不可预测的免疫反应,因此需要通过工艺纯化使得终产品中的HCP的残留量尽可能低(<100ppm),并建立良好的方法来检测HCP。酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前HCP检测的常见方法,然而开发特定工艺的专用ELISA试剂非常耗时(六个月以上)且开发成本昂贵,并只能测定HCP总量,而不能对每种蛋白进行鉴定和定量。其次,通用的ELISA试剂盒的专属性差,无法完全覆盖样品中全部HCP种类。LC/MS由于高分辨高灵敏度等优异性能,可对生物制品中的HCP进行全面鉴定和定量分析(定量下限可达1ppm以内,动态范围5-6个数量级)。对于生物制药而言,使用更加先进准确的分析方法,获得更加准确可靠的数据是至关重要的,更有助于通过申报与审批。

 

【难点】

 

LC/MS分析HCP最主要的难点在于结果的重现性和可靠性,要求高效液相及高分辨质谱本身具有的良好的重现性,在数据分析上也要进行严格筛选,三次重复实验中至少两次鉴定到该蛋白,且unique peptide≥2。此次报告中提出了一套完整的HCP分析方法流程:使用Lilly礼来[1]的非变性蛋白酶解方法,将抗体和杂蛋白分离(smart digest试剂盒及KingFisher能够严格控温、且前处理高效);高效液相色谱(使用常规液相即可得到理想的结果)及质谱的高度重现性使鉴定结果更加准确,Proteome Discoverer严格的数据筛选及Biopharma Finder深度表征分析,可定量<1ppm的蛋白,且重现性良好

 

3.png赛默飞HCP鉴定和定量方案

(点击查看大图)

 

4.png液相重现性良好:8针VS18针进样

(点击查看大图)

 

如果使用Orbitrap高分辨质谱平台Exploris 480,能够实现鉴定灵敏度及动态范围的进一步提高。那么如何进行合理的实验设计?质谱方法的参数设置?鉴定结果可做到什么程度?这些问题都会在此次报告中给出答案,精彩不要错过!

5.pngNIST mAb MS2 data acquired from exploris 480

(点击查看大图)

 

 

【扫码了解完整讲座】

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参考文献:

1. A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies. Anal Chem. 2017 May 16;89(10):5436-5444.

 

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