背景引入
近年来，分析技术的不断发展进步，特别是高分辨质谱仪和半自动软件平台的创新，为制药企业及CRO、CMO公司提供了更加可靠、高效的工具。比如，使用质谱技术能够区分密切相关的组分并对这些组分进行定量测量。[1]这其中，发展最为迅速的就是获得大家广泛关注的MAM策略。2019年，FDA对MAM应用于QC提出了指导性的建议，即需要解决四部分问题，包括风险评估、方法验证、未知物质谱检测（New peak detection，NPD）功能的能力和特异性考察、以及与传统方法的比较。这也使得MAM的定义更加明确，MAM的策略开发更有依据。 [2]
1. 关于多质量属性方法MAM
Multi-Attribute Method（MAM）的概念最早源于安进公司（Amgen）MS in QC 项目，旨在通过建立基于质谱（MS）的一种自动化分析方法，即可实现在整个开发和制造过程中，同时对治疗分子的多种产品质量属性（Product Quality Attributes, PQAs）进行并行监控与深入分析，以符合监管机构推荐的QbD（质量源于设计，Quality by Design）理念。[3]
MAM代表了一种优化的分析解决方案，专注于了解那些对治疗分子发挥生物学功能至关重要的属性，有望以其提供的单个 LC-MS 实验来取代多个传统的 QC 放行和稳定性测试方法（包括传统电泳和色谱方法）。高分辨高灵敏度的质谱技术的应用，保障了MAM对定性和定量信息的高选择性和高灵敏度，助力在分子水平上了解对复杂生物治疗分子安全性和有效性关键的属性；MAM在流程开发、生产和药物处置过程中遵从QbD原则，能够显著节约时间、实验室空间等成本。
MAM包含几个核心要点——一次采样同时监测多个复杂的关键质量属性。对于复杂的生物制品，MAM将有广泛的应用前景。以活细胞制备的生物类似药为例，由于生物分子本身的敏感性，生产工艺的微小变化，很可能导致终产品中某些关键质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）的差异，从而最终影响药物的临床效果。这些关键质量属性的表征很大部分都可以通过肽图相关方法分析实现。由此，我们不难得出结论，MAM被定义为依赖高分辨质谱仪完成的基于肽图的蛋白类药物的分析流程。之前的微信稿就具体的应用案例进行了详细介绍。[3]
2. MAM之外的合规质控需求
MAM流程涵盖从上游研发到下游QC质控的全部阶段，对于软件平台、硬件系统、工作流程及MAM的支持团队都提出了非常高的要求。[4]除此之外，不少QC实验室也开始逐渐将质谱放行纳入其GMP体系。尽管这类应用不同于MAM，但也是质谱进入QC实验室的另一重要方向，最具代表性的就是分子量质量控制分析。
2.1 合规环境下的完整蛋白去卷积用于单克隆抗体的质量确认[5]
使用液质联用技术进行蛋白的分子量分析，无论在变性还是非变性条件下，采集的质谱图上都能够检测到实际存在的不同的电荷态。而由于电荷态数量和范围的差异，导致了不同的检测 m/z 范围。通过解卷积软件选择合适的解卷积算法，可以实现对蛋白分子理论分子量的计算。在赛默飞BioPharma Finder软件和Chromeleon CDS软件中包含两种解卷积的方法：其中，对于那些可以实现同位素分辨的数据，需要使用Xtract算法进行计算；对于无法实现同位素分辨的样品数据，如单克隆抗体等较大的蛋白分子，需要使用Respect解卷积算法。
根据实验中掌握的分析样品的有效信息，可以将解卷积分析流程分为靶向或非靶向两种方式执行。非靶向方法适用于分析没有理论的质量或质量列表可用的未知样品。此时，可以将保留时间窗口缩小到已经观察到或预期的色谱峰的区域。而当已知理论质量的分布范围甚至是质量列表时，可以选择靶向方法进行分析，如单抗的高丰度糖型。
图 1 概述了通过BioPharma Finder软件和 Chromeleon CDS软件中的完整蛋白分析模块获得质谱解卷积结果的上述两种数据分析流程：靶向方法需要从 BioPharma Finder软件的序列管理器开始，它允许导入 FASTA 格式的蛋白序列文件，以及定义整个修饰列表（包括二硫键、糖基化、N 端和 C 端截断等）；下一步是 BioPharma Finder 软件中的解卷积，在考虑到选定的固定或可变修饰时，将解卷积获得的质量与所选蛋白序列的质量相匹配；BioPharma Finder 软件在结果列表中按名称和相关修饰列出所有匹配的组分，可以根据需要将所有或部分组分导出到蛋白工作簿（图 1C），其中包括了选定组分的质量、保留时间和修饰信息；此外，工作簿中包含了实验数据和蛋白质序列的相关信息，以及解卷积分析中应用的所有处理参数；Chromeleon CDS 中的目标蛋白质解卷积从导入完整蛋白工作簿开始，该工作簿是生成处理方法的基础。由于工作簿包含所有必需的参数，因此无需进一步输入即可完成处理方法的构建。
图1 高分辨质谱的靶向和非靶向数据解卷积流程图
赛默飞使用新型Orbitrap Exploris 240质谱仪，进行了连续50针单抗进样，整个数据采集和数据处理都由Chromeleon软件完成。Chromeleon软件导入了BioPharma Finder 软件生成的完整蛋白工作簿，应用靶向解卷积方法，生成包含完整分析结果总结的报告。
2.2 基于Chromeleon软件的核酸样品分子量合规质量控制[6]
寡核苷酸药物，是继第一代小分子药物，第二代抗体等蛋白药物后，被称为“第三代药物革命”的药物，是多种疾病特别是罕见疾病的基因治疗的直接治疗剂，属于生物制品的范畴[7]。目前被大家广泛熟知的核酸药物产品的代表，就是近两年针对新型冠状病毒的mRNA疫苗。自今年3月起，全国各地突发疫情“倒春寒”，此起彼伏的疫情更是牵动着全国人民的心。今年4月上旬，国家药监局更是先后批准了石药集团、康希诺生物等的mRNA疫苗的临床试验。[8]
寡核苷酸药物从发现、开发到质量控制的各个阶段，都离不开表征环节，因此需要依靠先进的分析技术与工具。液质联用技术是生物制品最重要的表征手段之一。高分辨质谱技术可以实现对样品的定性与精确定量[5]，特别是能够帮助质量控制（Quality Control，QC）实验室实现快速有效的定性与定量分析。
图2 基于BPF软件对引物P1解卷积的分析结果展示
赛默飞开发了一种基于Chromeleon软件的核酸样品分子量合规质量控制流程。使用Chromeleon软件实现对超高分辨质谱仪器的合规及流畅控制，成功完成对未修饰的核酸产品及巯基修饰的核酸产品的质控分析，从而提供了一种适合于核酸药物质量控制，以及应用于产品放行的新手段。该流程具有以下优势：
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1，具有解析核酸样品的精确分子量的能力；
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2，能够对产品主成分和主要杂质进行鉴定（图2、图3）；
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3，可以对不同组分进行相对定量（图2、表1）；
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4，成功应用于更加复杂的修饰核酸样品的分析，并为引物的正确使用提供可靠建议。
图3 基于Chromeleon的靶向分子量解析结果界面示例。
表1 修饰引物P2和P3的相对定量结果
3. 小结与展望
随着高分辨质谱技术和半自动软件平台的创新发展，以多属性方法（Multi-Attribute Method，MAM）为代表的“质谱走入QC”已成为一种大趋势[1]。创新型的超高分辨质谱仪，如赛默飞在2021年新推出的Orbitrap Exploris MX质量分析器，性能优异，在未来应用于生物制药生产和质控实验室的样本分析方面，具有巨大的潜力。
参考文献：
[1] Rogers, S.R. et al. Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics. mAbs 7:5, 881-890 (2015)
[2] Rogstad, S. et al. Multi-Attribute Method for Quality Control of Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 91, 14170−14177 (2019)
[4] 赛默飞邀您新年共赴MAM之旅
[5] Monoclonal antibody mass confirmation using intact protein deconvolution for a compliance-ready manufacturing environment. Application Note 73884 (2020)
[6] 基于Chromeleon软件的核酸样品分子量合规质量控制. Application Note 22013_LSMSLM (2022)
[7] Khvorova A.& Watts K.J. The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility. Nat. Biotechnol. 35, 238–248 (2017)
[8] 国金证券：mRNA疫苗临床新获批，看好疫苗及其上游供应链投资机遇（附股）
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Thermo Fisher Scientific
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