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技术专家
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1.前言


生肉并没有味道,肉制品在熟制过程中,风味前体物质通过一系列的理化反应,如:美拉德反应、脂质降解、糖降解、肽和氨基酸降解、硫胺素热降解等,生成一系列小分子的挥发性化合物,最终成就了熟肉变幻万千的香气。

 

就烤肉而言,烤制过程中氨基化合物(氨基酸、蛋白质、肽)和还原糖之间发生的反应,即:美拉德反应,是烤肉风味形成的关键。美拉德初始反应羰氨缩合、分子重排后,将进一步反应形成糖类脱水或降解产物,生成:糠醛、呋喃酮衍生物、羰基酮、二羰基化合物等。同时,α-氨基酸脱氨、脱羧发生Strecker降解反应生成其对应的醛类物质。含硫氨基酸同时会生成硫化氢、氨、乙醛等化合物。上述提及的美拉德中间产物同时会进一步参与美拉德反应,生成其他的挥发性香气物质,如:吡嗪、吡咯、呋喃(酮)、噻吩、噻唑、噁唑等。

 

此外,脂质降解反应在肉类特征风味形成过程中也十分重要,不饱和脂肪酸双键α位上亚甲基的活性较强,被催化剂引发自由基链式反应之后,直到体系内自由基形成稳定化合物后,反应才得以终止。油脂的自动氧化反应形成的氢过氧化物会降解生成一系列短链醛、酮、醇类化合物。不同肉类之间由于脂肪酸组成的差异,脂质降解反应生成的短链饱和/不饱和脂肪醛也有较大差异,因而造就了各种肉类的不同风味。同时,脂质降解产物还可以继续参与美拉德反应,生成复杂的烷基杂环化合物。


关于不同种类肉品特征香气成分的研究,文献已有不少报道,其前处理多采用液体进样方式,如:液液萃取、同时蒸馏萃取、同时辅助蒸馏萃取等,这些方法通常需要搭建一系列装置进行,耗时长、步骤繁琐、且需耗用大量有机试剂、成本较高。近年来,顶空-固相微萃取(HS-SPME)在食品香气分析中被广泛应用,但是在肉制品的风味分析中却因为关键化合物浓度过低,而自动进样器又限制了样品的装样量,使得应用受到局限。

 

固相微萃取结合传统的四极杆GC-MS分析肉制品香气的方法有两大不足:1. 能够检测出来的挥发性化合物数量少;2. 关键香气活性化合物(如含硫化合物、吡嗪等)缺失;含硫化合物和吡嗪类物质形成于肉品烤制过程中的美拉德反应和硫胺素降解,在肉制品中通常浓度极低(ppt-ppb级别),但他们也拥有较低的阈值(容易被人所闻见),这两类物质是贡献肉味、肉汤、烧烤香气的极其重要的化合物。


本文采用无溶剂、环境友好、且快捷方便的SPME作为进样方式,利用超高分辨率的静电场轨道阱质谱仪(GC-Orbitrap/MS)其无与伦比的灵敏度表现,来对不同种类烤肉中挥发性香气成分进行分析,使用赛默飞TraceFinder 4.1 软件Deconvolution Plugin自动完成化合物定性分析,通过化合物的解卷积质谱图与现有的商业标准谱图库NIST 2017进行检索匹配,所有检索结果结合检索正相关(SI)得分、高分辨过滤(HRF)值、Kovats保留指数(RI)进行综合评分排序,使得定性结果更可靠。


2. 实验条件


2.1 样品前处理:


取土猪肉、黑猪肉、普通猪肉、羊肉和牛肉5种不同类型的15个前腿肉样本剪成薄片,用锡纸包裹,置于200℃烤箱中烤制1.5 min。取出后自然放凉,打开锡纸,将烤好的肉剪成小颗粒备用。

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图1:顶空瓶中的待测样品


2.2 仪器和方法设置:


2.2.1 质谱:

使用GC-Orbitrap 质谱仪分析样品。使用Thermo ScientificTM TriPlusTM RSH自动进样器进行自动化进样,并且使用Thermo ScientificTM TRACE TM1310 气相色谱仪和Thermo ScientificTM TraceGOLD TG-5 30m×0.25 mm(内径)×0.25 μm(膜厚)毛细管色谱柱实现色谱分离。采用全扫描采集进行样品分析。


2.2.2 自动进样器:

顶空-固相微萃取:选用85μm CAR/PDMS 萃取头;取 3 g 熟肉样品于 20mL 顶空瓶
中;55℃平衡5min,然后以55℃萃取35min,在进样口(250℃)解析3min;每个样品之间,萃取头于270℃老化10min,以防止样品间污染。


2.2.3 GC色谱条件:
进样口:SSL分流/不分流进样口,250℃;分流比:10:1;载气:He,1.2 mL/min;
程序升温:40℃保持2min,以8℃/min升到150℃,保持1min,然后以20℃升到280℃,保持5min;
传输线温度:250 ℃


2.2.4 Orbitrap质谱条件:
分辨率选择:30,000 FWHM(200 m/z)
扫描范围:33-350 m/z,全扫描(Fullscan模式)
EI模式下离子源温度:250 ℃;电子能量:70eV


2.3数据处理:


使用Thermo ScientificTM TraceFinder(version 4.1)采集数据。Tracefinder Deconvolution Plugin通过质谱优先的数据处理方式,提取所有离子通道(提取离子流图,EIC),并通过顶点重合度来判定峰的归属,然后将解卷积之后“干净”的质谱图与商业数据库(NIST、Wiley等)进行比对,Deconvolution通过SI值(正向匹配度)、HRF值(高分辨过滤分值)、和RI(保留指数),对解卷积后的结果自动排序,完成未知化合物的定性分析。15个样品的数据最终通过PCA分析,完成不同种类肉的区分和鉴定。

 

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图2:Thermo ScientificTM TraceFinder(Version 4.1)界面


3. 结果与讨论


3.1 不同品种烤肉中挥发性化合物的GC-MS 结果分析


烤肉中挥发性香气化合物鉴定结果如图3所示:15个样本中共鉴定出挥发性化合物99种,其中酸(8种)、醛(17种)、酮(9种)、酯(2种)、醇(5种)、吡嗪(15种)、呋喃(4种)、含硫化合物(9种)、烯萜(6种)、杂环化合物(2种)和其他(22种)。

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图3:各类挥发性化合物在不同烤肉中的分布情况(Area%)


其中,醛类和含硫化合物是其中占比最多的化合物,猪肉、黑猪和土猪肉中醛类化合物含量最高,分别占总峰面积54.82%、48.51%和58.46%;牛肉和羊肉中醛类化合物占比相对较少,为18.71%和26.79%;牛肉中含硫化合物含量相对较高,为58.27%,其次是羊肉(41.03%),猪肉中最少(10.25%);同时,酮类、吡嗪类和醇类化合物也是肉类挥发性化合物的重要组成部分。

 

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表1:SPME-GC-Orbitrap/MS鉴定出的17种醛类化合物

 

挥发性化合物中醛类物质形成于脂质降解反应,其前体物质多为长链饱和/不饱和脂肪酸,是区分不同品种肉的特征一类重要化合物。本实验共检测出17种醛类物质(见表1),己醛(7.98%-40.10%)、戊醛(2.19%-12.34%)、苯甲醛(3.61%-6.04%)是其中含量最高的三种醛类化合物。三种猪肉中的己醛含量最高,分别占总峰面积的27.75%-40.1%不等,反-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、反-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛是猪肉中的特征化合物,在牛肉、羊肉样品中几乎未检出。

 

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表2:SPME-GC-Orbitrap/MS鉴定出的9种含硫化合物

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表3:SPME-GC-Orbitrap/MS鉴定出的15种吡嗪类化合物

 

烤肉中特征的“烤”味和“肉”味化合物,即:吡嗪类化合物和含硫化合物分别检出15种和9种(表2、表3)。其中,二硫化碳是含硫化合物中含量相对最高的化合物,占8.99%-55.76%;牛肉、羊肉中含量最高,其次是黑猪肉和土猪肉,普通猪肉中二硫化碳含硫最低。甲硫醇(0.44%-1.23%)和二甲基二硫醚(0.21%-1.62%)是含量仅次于二硫化碳的化合物,在羊肉和黑猪肉中含量最高,其次是牛肉、土猪肉,普通猪肉中含量最低。吡嗪类化合物的产生源自生肉样品烤制过程中的美拉德反应,甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪是其中含量较高的。

 

3.2 PCA结果分析


PCA分析结果显示:3个土猪肉样品之间的差异较小,而牛肉、黑猪肉和普通猪肉的三个样本之间存在一定差异;本实验中牛肉和羊肉呈现出的挥发性化合物组成较为类似;猪肉的挥发性化合物相对含量的组成明显异于牛肉和羊肉,尤其是普通猪肉;黑猪肉的化合物组成不仅拥有猪肉的共性特征,与牛羊肉也有一定的相似之处,介于三者之间,比较有特色。土猪肉的三个样品之间差异较小,其挥发性化合物组成明显有别于普通猪肉和牛羊肉,与黑猪肉有一定的共性。

6.jpg图4:不同种类肉品PCA分析结果图

4.结论


本实验通过利用超高分辨静电场轨道阱气质联用仪(GC-Orbtirap/MS)结合顶空-固相微萃取(HS-SPME)分析不同品种烤肉的挥发性香气化合物,得益于GC-Orbtirap/MS的超高灵敏度,使得SPME充分发挥出其简单快捷的优势。整套方法囊括“样品制备—SPME萃取—GC分离—质谱检测—数据分析—数据统计”的工作流程,使GC-Orbitrap/MS系统成为未知挥发性化合物分析的强大工具。全自动进样平台结合卓越、稳定的色谱分离,再匹配Orbitrap/MS系统无与伦比的分辨率和灵敏度,使得GC-Orbitrap/MS成为食品组学分析的理想平台。Tracefinder Deconvolution通过独特的解卷积算法,能够匹配现有的GC-MS商用库使用,通过匹配度(SI/RSI)、高分辨过滤分值(HRF Score)和保留指数(RI),得到可信度最高的定性结果。GC Orbitrap/MS 作为业内唯一一款气相色谱超高分辨质谱仪,集超高分辨率、高质量精度测定、高灵敏度于一体,在食品香气成分鉴定、未知物分析、食品组学等方面表现出了强大的能力,能够很好应对复杂样品中痕量物质分析的挑战。

 

仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。 

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‎09-01-2022 10:00 AM
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