案例分享---Orbitrap高分辨质谱助力疫苗糖基化表征

技术专家 · ‎10-14-2022

2019新型冠状病毒（COVID-19）是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。冠状病毒是正义单链RNA病毒，病毒颗粒外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白（S糖蛋白）、小包膜糖蛋白及膜糖蛋白，其中S糖蛋白是病毒感染性的决定因素。病毒进入人体后，就是通过S糖蛋白与细胞表面的血管紧张素转化酶2（ACE2）结合，从而入侵人体细胞。

因此，S糖蛋白也成为了疫苗、治疗性抗体和诊断方法的关键靶标，近年热门的重组疫苗、核酸疫苗等瞄准的突破口也是S糖蛋白（作为合成的目标蛋白）。然而S糖蛋白结构复杂，往往具有多个糖基化位点，且每个位点具有多个聚糖结构，因为对其糖基化位点及结构的分析非常具有挑战性。Orbitrap高分辨质谱优异的性能在重组疫苗糖基化表征分析上有着出色的表现，使得疫苗的开发及质量控制更加准确、高效。

疫苗的糖型表征包括完整蛋白、肽图及游离寡糖分析，如下图所示，通过完整蛋白分子量分析，可得知蛋白主要糖型及占比；肽图分析中CID、HCD及ETD等多种碎裂模式可准确判断糖基化位点及糖型结构；游离寡糖分析可进一步确证糖型结构。

▲重组疫苗糖型分析流程图（点击查看大图）

糖化位点占有率评估

案例一

HIV疫苗开发策略中很重要的一步是观察到某些受感染的个体产生广泛中和抗体，这些抗体靶向病毒包膜糖蛋白的聚糖表位，但糖基化位点的位置和占据程度是多种多样的。因此，需要了解重组免疫原上糖基化的占有率。HIV疫苗的N糖基化位点通常有近30个，且高甘露及复杂糖型居多，由于异质性高，在完整蛋白层面很难对糖型表征，然而相对于糖肽水平上的分析，在完整糖蛋白水平上能够更快速评估及监控。

本文作者通过使用α-甘露糖苷酶抑制剂改变重组gp120的聚糖加工过程，以生成均一化的糖型，Figure 1B中游离寡糖的质谱图显示，在Kifunensine抑制剂存在下，使得蛋白由内质网分泌到高尔基体的过程中，N糖基上的甘露糖本应被修饰为复杂糖型这一过程被阻断，形成Man9糖型，及很少量的Man8，很大程度降低了糖蛋白的异质性。因此，可以在完整蛋白层面观测到Man9，少量Man8及O糖，并可根据Man9的糖型数目推断糖化位点占有率。分析结果显示gp120单体包含完全糖基化（占比40.6%），及缺失一个（41.6%）或两个（17.8%）聚糖(Figure 2C). 由于O糖基化及不同占比的N糖基化在完整蛋白层面形成的质量偏移，能够通过Orbitrap高分辨高灵敏度性能清晰的区分(Figure 2A)。

▲Figure1. (A) Expression strategy to produce an oligomannose-type glycoformof gp120. (B) ESI-MS of N linked glycans released by proteinN-glycanase F. (C) Tandem mass spectrometry of negative N-glycan ions（点击查看大图）

图片

▲Figure2. Intact mass spectrum of BG505 gp120 transiently expressed in thepresence of kifunensine. (A) Spectrum revealing six distinct ionspecies within each charge state (inset). The major ions areseparated by an 1864 Da mass shifts (blue, inset) equal to a singleMan9. (B) MS spectrum of released O-glycans that correspond to thepeak shifts observed in the intact spectrum (pink circles, top). (C)Deconvoluted spectrum to quantify the major peaks.（点击查看大图）

案例二

评估蛋白糖基化位点的聚糖类型有助于设计改良的候选疫苗，本文作者介绍了一种基于质谱的蛋白质组学策略，先用多酶酶切获得高的序列覆盖度，接着通过特定的糖苷内切酶，形成特征质量差(Figure 3a)用以区分未糖基化及非糖基化位点，通过该方法可对糖基化状态进行半定量分析。

如下图所示，结果显示重组HIV-1包膜糖蛋白（Env）中的大多数特征糖化位点Asn-X-Ser/Tr/Cys完全糖基化，其中高甘露糖型和复杂糖型的比例各不相同（Figure 3d）。该方法适用于任何糖蛋白的位点特异性糖基化分析，促进疫苗免疫原的合理设计和开发。

▲Figure3.Schematic representation of a method and to determine site-specifificglycosylation of BG505 SOSIP.664 trimer. (b) The workflflow of themethod present in this study. (c) Scatter plot of the site-specifificglycosylation of BG505 SOSIP.664 trimer purifified with Ni2 þ /SEC.(d) Colour-coded bar graph of the site-specifific glycosylation ofBG505 SOSIP.664 trimer.（点击查看大图）

糖型结构表征

案例一

流感病毒糖蛋白的糖型非常复杂，通常具有多种多样的双，三和四天线结构，并在侧链上修饰岩藻糖基化，唾液酸化，硫酸化等基团。本文作者总结了此前所有表征过的流感疫苗N糖结构，并录入Bionic数据库中，通过高分辨质谱表征分析，结合数据库高通量筛查，在五种流感疫苗中共鉴定到1380个特征N糖肽，包括514个硫酸化N糖（N糖硫酸化能增强蛋白的亲和能力，与病毒复制及受体结合相关联），结果显示在流感糖蛋白中，有近60%的糖型发生了硫酸化，超出之前研究的结果。此工作中新发现的N-聚糖结构的及已开发的N-聚糖结构数据库对后续更广泛的糖蛋白组学研究很有帮助。

Figure4显示糖型表征图谱，通过低能量的CID碎裂获得糖型的多种碎片峰，结合一级分子量信息可推断糖型信息；接着选定仅含N-乙酰氨基葡萄糖的肽段做MS3分析，通过b、y离子可获得肽段序列信息（或通过ETD碎裂得到序列信息）。同样方法适用于硫酸化的N聚糖分析，通过高分辨质谱获得的精确分析量信息及S同位素峰簇，可区分中性丢失为SO3而非PO3H.对于硫酸化N聚糖异构体，可通过orbitrap丰富的B、Y离子碎片确证硫酸修饰的位点（Figure5）。Orbitrap高质量MS/MS谱图助力于复杂糖型的准确表征分析，对于疫苗多糖化位点，复杂糖型及硫酸化等PTMs修饰，可获得准确且全面的表征结果。

▲Figure4.(A)Full MS scan of glycopeptide.（点击查看大图）

▲Figure4.(B) Glycan sequencing by MS/MS at theprecursor ion of m/z 1309.55.（点击查看大图）

▲Figure4.(C) Peptide sequencing by MS3fragmentation of the abundant monoglycosylated peptide ion at m/z 906.61.（

点击查看大图）

▲Figure5. MS/ MS spectrum of sulfated N-glycans.The difffference between twoisobaric structures is highlighted in a dashed line rectangle.（点击查看大图）

案例二

本文作者通过高分辨质谱表征手段，比较了293T细胞中瞬时转染和稳定转染表达的HIV1包膜蛋白gp140，包括测序、二硫键分析及N糖O糖分析。二硫键及糖型分析中，充分利用了Orbitrap三合一高分辨质谱的多种碎裂模式，CID碎裂获得PTMs碎片信息，ETD碎裂在保留PTMs基团的条件下，获得肽段序列信息，从而更全面的对复杂二硫键及N、O糖表征分析。

结果显示通过两种方式表达的糖蛋白，其糖化位点及占比几乎相同，二硫键均表现出类似的异质性（存在于大多数重组表达蛋白中），表明PTMs修饰没有明显变化，这对于依赖通过瞬时转染获得的数据来设计稳定细胞系中表达的疫苗开发者而言，具有重要参考意义。