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技术专家
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二硫键是在细胞内蛋白质生物合成过程中,在两个半胱氨酸(Cys)的硫原子之间形成的蛋白质的翻译后修饰。二硫键在蛋白质折叠过程中起着重要的作用,稳定蛋白质的天然高阶构象,这些构象是执行其生物功能所必需的。蛋白质中二硫键连接模式的定位为蛋白质稳定性、结构-功能关系以及二硫键介导的蛋白质亚型的研究提供了重要信息。此外,二硫键的表征在生物制药的开发过程中具有重要的意义,以确保生物制剂的安全性和有效性。然而由于生物分子的复杂性,对蛋白质中二硫键的精确表征分析仍具有一定的挑战性。

 

随着质谱技术的出现,液相色谱-质谱联用方法已成为蛋白质二硫键分析的重要技术手段[1]。常用的质谱碎裂技术如碰撞诱导解离(CID)、高能碰撞解离(HCD)、电子捕获解离(ECD)和电子转移解离(ETD)等都可以直接应用到二硫键的碎裂分析中[2-6]。ETD 是由弗吉尼亚大学Donald F. Hunt 博士发明[7],由ECD 发展而来,但ECD仅能在高端的FT ICR 高分辨质谱上使用。赛默飞从弗吉尼亚大学获得ETD专利技术,于2007年在离子阱液质平台上商品化出创新的ETD 裂解源[8]

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不同的碎裂模式对于化学键的断裂各有特点, 选择合适的碎裂技术及数据采集技术的组合对于促进MS/MS数据中二硫键的解析至关重要。ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法,通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂,引发多肽序列碎裂,获得蛋白质翻译后修饰的重要序列信息。与CID碎裂机理相比,对于ETD技术的机理研究则相对匮乏,ETD的有关碎裂机理、碎裂行为特征与CID/HCD产生的碎片离子不同,其碎裂特征与ECD具有高度相似性,主要产生c和z碎片离子。

 

二硫键的裂解是ETD裂解的主要反应途径,犹他大学Jack Simons等人通过理论模型计算研究了电子如何结合到带正电的多肽上,结果表明特定的激发里德堡态(Rydberg State)在电子顺利转移到二硫键的SS s*轨道上起了决定作用。当阴离子供体,激发里德堡态和二硫键的SS s*轨道在空间上相邻,能量上相近时,电子就顺利地从阴离子供体穿梭到SS s*轨道上,最终导致二硫键的碎裂[9]

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清华大学瑕瑜教授在普渡大学期间系统研究了链内二硫键的碎裂机理,发现链内二硫键形成的环形区域肽骨架可碎裂形成c (基电子), z (偶电子), c-33 Da, z+33 Da, c+32 Da, 和 z–32 Da 等各种形式的碎片离子。这些碎片离子的存在意味着通过电子转移的形式造成二硫键及肽段N–Cα 键均发生碎裂。通过研究碎裂机理表明,N–Cα 键先碎裂, 自由基引发的反应促使半胱氨酰残基区域的S–S键或S–C 键的碎裂。价态还原后的肽段丢失33 Da (SH)的碎片意味着ETD直接碎裂二硫键的现象也同时存在,这种趋势在低价态的肽段上会更加明显,相反在高价态时更容易发生肽骨架碎裂[10]

 

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此后对于含有两对链内二硫键的模型肽段研究表明,ETD同样能获得丰富的序列信息(c/z离子) 。碎裂机理研究表明,两对链内二硫键覆盖区域的c/z 离子的产生是经过初始的 N–Ca键碎裂,随后引发自由基级联反应碎裂不同的多对二硫键。由于自由基级联反应,ETD 碎裂不同连接位置的两对二硫键异构体具体相似的碎片离子,但是碎片离子的相对丰度某种程度上存在一定的差异,此可帮助区分二硫键位置异构体[11]

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ETD需要高电荷离子才能更加有效地捕获电子及发生裂解,在ETD的反应过程中,虽然很容易的发生电子转移,但气态离子的非共价键结合会抑制特征碎片的生成(ETnoD)。将ETD反应之后的离子进行HCD/CID的二次碎裂,可有效的打开非共价键结合离子及电荷还原态母离子,获得更多的序列碎片信息[12]。此外对于复杂的多对二硫键的肽段,ETD和CID/HCD都不足以作为一种独立的技术来明确地定位复杂的二硫键连接性。在这种情况下,结合ETD和CID/HCD的多种碎裂模式及多级质谱功能将是破译二硫键连接性的理想方法。

 

来自赛默飞的Stephane Houel 等人在Orbitrap Fusion三合一质谱平台开发一种方法,该方法利用ETD-MS2解离链间二硫键,然后对单条肽链进一步进行HCD-MS3碎裂获得序列信息[13]。安进公司的Xiaoyan Guan等在Orbitrap Elite质谱平台上同样利用了ETD MS2-triggered CID MS3的三级模式对免疫球蛋白G2中的二硫键进行了深入的表征[14]

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本文总结

随着质谱技术的不断发展,数据处理软件算法的不断升级,以及新的裂解技术的出现及碎裂机理的不断完善,必将对二硫键的分析带来更好的体验。

 

参考文献:

[1] Pei-Lun Tsai, Sung-Fang Chen, Sheng-Yu Huang. Mass spectrometry-based strategies for protein disulfide bond identification. Rev Anal Chem. 2013, 32(4), 257–268.

[2] Li-Juan Huang, Chia-Wang Chiang, Shun-Li Chen, Shih-Yao Wei, Shu-Hui Chen. Complete mapping of disulfide linkages for etanercept products by multi-enzyme digestion coupled with LC-MS/MS using multifragmentations including CID and ETD. J Food Drug Anal. 2019, 27, 531-541.

[3] Shiaw-Lin Wu, Hai-tao Jiang, Qiao-zhen Lu, Shu-jia Dai, William S. Hancock, Barry L.

Karger. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using On-line LC-MS with electron transfer dissociation (ETD). Anal Chem. 2009, 81(1), 112–122.

[4] Barbara Ganisl, Kathrin Breuker. Does Electron capture dissociation cleave protein disulfide bonds?. Chemistry Open. 2012, 1, 260 – 268.

[5] Marija Mentinova, Hongling Han, Scott A. McLuckey. Dissociation of disulfide-intact somatostatin ions: the roles of ion type and dissociation method. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2009, 23, 2647–2655.

[6] Xiao-juan Li, Xiao-yu Yang, Van Hoang, Yan-Hui Liu. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2019, 30, 519-528.

[7] Syka JE, Coon JJ, Schroeder MJ, Shabanowitz J, Hunt DF. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci USA. 2004, 101, 9528–9533.

[8] Frederik Lermyte, Dirk Valkenborg, Joseph A. Loo, Frank Sobott. Radical solutions: Principles and application of electron-based dissociation in mass spectrometry-based analysis of protein structure. Mass Spec Rev. 2018, 1–22.

[9] Diane Neff, Sylwia Smuczynska, Jack Simons. Electron shuttling in electron transfer dissociation. Int J Mass Spectrom. 2009, 283, 122–134.

[10] Scott R. Cole, Xiao-xiao Ma, Xin-rong Zhang, Yu Xia. Electron transfer dissociation (ETD) of peptides containing intrachain disulfide bonds. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23, 310-320.

[11] Lei Tan, Kirt L. Durand, Xiao-xiao Ma, Yu Xia. Radical cascades in electron transfer dissociation (ETD) – implications for characterizing peptide disulfide regioisomers. Analyst, 2013, 138, 6759.

[12] Fan Liu, Bas van Breukelen, Albert J. R. Heck. Facilitating protein disulfide mapping by a combination of pepsin digestion, electron transfer higher energy dissociation (EThcD) and a dedicated search algorithm SlinkS. Mol Cell Proteomics 2014, 13, 2776–2786.

[13] Stephane Houel, et al. Disulfide bond identification of biotherapeutic proteins using various fragmentation techniques available on an orbitrap fusion tribrid mass spectrometer. Poster Note 64808.

[14] Xiaoyan Guan, Le Zhang, Jette Wypych. Direct mass spectrometric characterization of disulfide linkages. MABS, 2018, 10, 572–582.

 

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