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第十一届中国蛋白质组学大会于10月15日在英雄的武汉顺利落幕,期间国内外蛋白质组学领域内的专家大咖们为与会者带来了一场学术的盛宴。本届蛋白质组学大会以“蛋白质组学驱动的精准医学”为主题,蛋白质组学在精准医学领域中的应用中,除了鸿篇巨制式的大临床样本量的蛋白质组学研究外,烹小鲜式的使用蛋白质组学的技术在疾病靶点、机制的发现中的应用同样精彩。

 

我们在这里分享一篇基于蛋白质组学技术进行骨关节炎疾病的分子机制研究的文章,本文由南京大学生命科学学院与中科院上海药物所合作,于2021年9月27日发表于专业领域杂志Arthritis Rheumatol,题目为“SHP2 inhibition attenuates osteoarthritis by maintaining homeostasis of cartilage metabolism via the DOK1/UPP1/uridine cascade”。

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骨关节炎(Osteoarthritis)是一种退行性关节病,其主要特点是关节软骨损伤及炎症、硬化;而软骨代谢的合成与分解平衡是改善关节症状功能的关键所在,其中合成代谢受到细胞因子与生长因子的刺激,它们可以诱导软骨形成相关基因如Sox9, Col2a1, Acan的表达;而软骨分解代谢则主要由IL-1β,TNF-α及IL-6等通过促进关节软骨细胞外基质降解来实现。本文正是试图寻找骨关节炎病程中软骨合成代谢与分解代谢的稳态的关键分子及调节机制。

 

蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)与蛋白酪氨酸激酶(PTK)协同工作,调节蛋白磷酸化水平。有文献报道PTK通过激活一系列相关途径参与了骨关节炎的发病过程,而PTP与骨关节炎的联系尚不清楚。为解决这个问题,研究人员首先在公开的单细胞转录组测序数据集里分析了107个酪氨酸激酶的表达情况,发现其中9个在骨关节炎中高表达的编码基因。随后在对骨关节炎患者软骨组织的RT-qPCR检测中,发现编码酪氨酸磷酸酶SHP2的PTPN11基因在这9个基因中表达量最高。同一患者的未受损区域与受损区域的比较却发现SHP2的蛋白及mRNA表达量并未发生显著变化,这一结果与在经IL-1β刺激的软骨细胞实验结果相同,与此同时SHP2的酶活显著提升,其酶活的显著提升很可能与蛋白的磷酸化水平相关。

 

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图1:在骨关节炎中高表达的编码基因(点击查看大图)

 

SHP2是由PTPN11编码的酪氨酸磷酸激酶,SHP2与发育障碍Noonan综合征、LEOPARD综合征等多种发育相关疾病关系密切,临床表现为身材矮小、颅面畸形、脊柱侧弯等,在小鼠实验及临床中的早期发育相关功能已被证实,但其在骨关节炎疾病中所起作用仍然存疑。为验证SHP2在骨关节炎疾病进展中的作用,作者进行了一系列实验,如使用SHP2的变构抑制剂SHP099对两种动物模型-不稳定内侧半月板手术模型和衰老模型进行处理,发现经SHP099处理的小鼠在接受手术后其软骨损伤减少且显著降低了表征软骨降解的如MMP13、MMP3、COLX等的表达,增加了软骨合成相关SOX9的表达。基于作者在不同维度上的实验,发现了抑制SHP2能够减弱软骨的损伤的表型,接下来需要对其作用机制设计实验进行探讨。

 

随后,作者采取定量蛋白质组学及翻译后修饰组学的方法对其作用机制进行研究。作者使用TMT-10plex的技术路线,对经IL-1β及IL-1β+ SHP099的样品与其对照组进行全蛋白质组学比较,共定量蛋白8167个,在IL-1β处理的细胞中,共得到177个差异表达蛋白。值得注意的是,有7个蛋白在经IL-1β处理后显著上调而在SHP099处理后则显著下调,另有4个蛋白表达则正好相反。这其中,UPP1表达量变化最引人瞩目:在骨关节炎的病程发展过程中,UPP1的表达量上调,而抑制SHP2表达则可降低UPP1表达水平。

 

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图2:基于TMT标记的定量蛋白质组学实验揭示SHP2抑制剂处理前后的骨关节炎细胞模型内蛋白质动态变化全景(点击查看大图)

 

UPP1是尿嘧啶核苷磷酸化酶,可以可逆的催化尿苷磷酸化为尿嘧啶,为验证UPP1的表达量降低在骨关节炎疾病中的作用,作者向受损关节中进行注射脂质体尿苷给药,结果显示,注射脂质体尿苷可显著减少软骨损伤和滑膜炎症,同时还下调MMP3,MMP13, COLX,上调SOX9的表达,这些结果表明UPP1 -尿苷通路参与了软骨稳态的调节。

 

为进一步研究SHP2如何参与UPP1 -尿苷通路,作者选择使用SILAC标记定量技术对酪氨酸磷酸化修饰组进行了系统性定量分析:共鉴定到1151个酪氨酸磷酸化位点,其中999个为高可信磷酸化位点(磷酸化位点打分>0.75)。与IL-1β处理组相比,经SHP099处理后DOK1Y397位点磷酸化水平最高,从而推测出DOK1为SHP2的底物。随后作者从不同角度去验证这个推测:COIP实验证实SHP2与DOK1存在相互作用,SHP099的处理可以显著削弱了这种相互作用,而过表达SHP2则可以显著增强这种相互作用;突变体实验也证实了DOK1Y397位点对UPP1表达量的影响。

  

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图3:基于SILAC标记定量的酪氨酸磷酸化修饰组学技术揭示SHP2介导软骨稳态失衡的分子机制(点击查看大图)

 

总结

文章使用标记定量蛋白质组学和酪氨酸磷酸化修饰组学的技术路线(TMT+SILAC),发现了在骨关节炎疾病中,酪氨酸磷酸激酶SHP2在维持软骨合成与分解的稳态的功能由SHP2-DOK1-尿苷轴实现,为骨关节炎疾病的治疗提出了新的方向。
@dongdan 
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