< 关键词>
COVID-19，SARS-CoV-2，SARS-CoV，蛋白质组学，磷酸化，泛素化，DIA
本篇解读蛋白质组学领域内大神Matthias Mann与来自慕尼黑工业大学病毒学研究所的合作者最新发表于Nature的文章，作者对SARS-CoV-2与SARS-CoV两种病毒进行了多个层次的组学研究，包括相互作用组和效应组以及宿主细胞的转录组，蛋白组和翻译后修饰层面的泛素化及磷酸化蛋白组，进一步揭示了SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒对其宿主细胞的干扰，以期锚定到相应的药物靶点并对疾病的治疗具有指导意义。
实验设计及数据采集方法
1. 相互作用组及效应组
> 相互作用组：SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒蛋白通过慢病毒转染人肺腺癌上皮细胞株A549细胞，实验表达了带有HA标签的病毒蛋白，而后进行亲和纯化与蛋白鉴定，以构建SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒与宿主细胞的相互作用组。
> 效应组：使用DIA采集模式，使用Thermo Fisher Scientific Q-Exactive HF-X仪器对上述表达的54种病毒蛋白的A549细胞进行全细胞的定量蛋白质组学研究。
2. 不同感染时间点的多组学分析
针对两种病毒不同感染时间点的蛋白组、磷酸化及泛素化蛋白质组学使用最新的Orbitrap Exploris 480，使用DIA采集模式完成：其中蛋白组与两种翻译后修饰组学的建库部分数据使用了FAIMS+Orbitrap Exploris 480组合来完成。
> 蛋白质组学：蛋白组DIA数据采集使用100min色谱梯度，在350-1650m/z范围内采集22个窗口(二级分辨率15000)，FAIMS使用了-40、-55和-70V三个电压。
> 磷酸化蛋白质组学：使用70min色谱梯度，在300-1400m/z范围内采集32个窗口(二级分辨率30000)完成，HCD碎裂采用Stepped NCE(25-27.5-30%);磷酸化数据构建谱图库时，FAIMS使用了-30,-40,-50,-60,-70, -80和-90V的7个不同的电压进行采集，以得到更加完善的磷酸化样品谱图库数据。
> 泛素化蛋白质组学：使用120min色谱梯度，在300-1350m/z范围内采集了46个窗口(二级分辨率30000)完成，在泛素化建库数据中，FAIMS采用-35,-40,-45,-50,-55,-60,-70和-80这8个不同的电压来采集。
实验结果
相互作用组和效果组
相互作用组数据共鉴定到1086个与病毒互作的宿主细胞蛋白，该结果极大丰富了目前人们了解到的SARS-CoV-2及SARS-CoV病毒与其宿主细胞相互作用组数据集。研究发现与SARS-CoV-2互作蛋白主要参与固有免疫、应激以及DNA损伤并与胞内运输复合体相互作用而参与细胞代谢。此外，两种病毒具有差异性的相互作用网络，这将有助于我们了解两种病毒不同致病性的原因。其中TGF-β通路可能与病人的肺部纤维化与水肿等并发症相关。
通过对宿主细胞的效应组研究则证实了病毒-宿主蛋白的相互作用与宿主蛋白表达量变化之间的关系，随后作者进一步着眼于180个受到扰动最大的宿主蛋白，并分析了如转录抑制因子RCOR3以及载脂蛋白B(apolipoproteinB ，APOB)受到病毒蛋白扰动的情况。
图1：相互作用组及宿主效应组实验（点击查看大图）
图2：SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒-宿主蛋白相互作用网络（点击查看大图）
在研究了上述单个病毒蛋白的实验基础上，作者又通过SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒转染A549-ACE2细胞，来研究不同的感染时间点的宿主细胞的转录组、蛋白组及磷酸化和泛素化翻译后修饰组的多组学扰动。
图3：不同感染时间点的多组学实验（点击查看大图）
全蛋白组学
共鉴定蛋白5862个，其中272个为SARS-CoV-2或SARS-CoV感染后的差异表达蛋白。差异蛋白主要影响如下调干扰素应答机制并激活促炎信号，调节TGF-β通路。
磷酸化蛋白质组
共定量到16399个磷酸化位点，经SARS-CoV-2或SARS-CoV感染后，有4643个磷酸化位点发生了变化。差异磷酸化修饰位点主要集中在MAPK通路、自噬通路及参与病毒进入的通路，并发现Ras超家族蛋白-RAB7A是SARS-CoV-2感染时重要的因素，促进ACE2的转运，且观察到了SARS-CoV-2感染后参与胞内定位的RAB7A的磷酸化位点S72的显著高表达。
泛素化蛋白质组
在鉴定到的16541个泛素化位点中，1108个位点发生了变化。其中差异泛素化修饰位点则表现在自噬相关因子的泛素化水平上调以及感染后期部分蛋白特异性的泛素化修饰及降解，如COVID-19病人内皮功能紊乱可能与内皮分化相关因子EDF1被泛素化降解相关。
随后作者对多个层次的组学数据进行整合分析，数据指向病毒蛋白对宿主细胞的自噬、固有免疫及对TGF-β通路的扰动作用。
图4：多组学数据鉴定及差异数据（点击查看大图）
图5：蛋白互作及宿主细胞扰动网路图（点击查看大图）
最后作者对抗病毒的48种干扰病毒复制通路的药物进行了基于数据的筛选与测试，基于通路抑制或蛋白酶抑制的药物Gilteritinib，Ipatasertib，Prinomastat和Marimastat具有较高的抗病毒活性。
图6：抗病毒药物筛选测试（点击查看大图）
总结
该研究中，作者展示了结合使用FAIMS进行DIA采集的两种策略，一是FAIMS3个电压+较少的窗口（22个）+略低的二级分辨率(15000)对采集密度与速度进行平衡；二是使用多个FAIMS电压为PTM样品构建谱图库更完备的谱图库，再进行非FAIMS的更多的采集窗口（如46个窗口）+较高的二级分辨率(30000)的DIA采集策略。
距离新冠这个“灰犀牛”事件爆发已经两年有余，包括本篇文章在内，全世界的科学家们投入了大量的资源，期待着依靠技术进步使得我们尽快寻找到特效的药物。而在此之前，目前最为有效和可控的抵御方法有且只有疫苗，也希望跟读者们一起响应号召接种疫苗，共筑免疫长城。
参考文献
1.Stukalov A, Girault V, Grass V, Karayel O, Bergant V, Urban C, Haas DA, Huang Y, Oubraham L, Wang A, Hamad MS, Piras A, Hansen FM, Tanzer MC, Paron I, Zinzula L, Enghleitner T, Reinecke M, Lavacca TM, Ehmann R, Wölfel R, Jores J, Kuster B, Protzer U, Rad R, Ziebuhr J, Thiel V, Scaturro P, Mann M, Pichlmair A. Multilevel proteomics reveals host perturbations by SARS-CoV-2 and SARS-CoV. Nature. 2021 Apr 12. doi: 10.1038/s41586-021-03493-4. Epub ahead of print. PMID: 33845483.
如需合作转载本文，请文末留言。
Thermo Fisher Scientific
United States
