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技术专家
Team TFS
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在当今蛋白质组学的研究热潮中,液质联用技术的应用已经非常广泛。在精准医学和大队列组学背景下,研究人员往往需要对大量样本实现快速高效检测。为了满足各实验室与日俱增的对复杂样品的检测需求,赛默飞作为蛋白质组学领域的领导者,最近三年接连推出了智能化Orbitrap Eclipse、Orbitrap Exploris系列质谱以及FAIMS Pro、FAIMS Pro Duo等新技术,大大提高提高了质谱的检测灵敏度及功能多样性。

 

除质谱外,液相作为LC-MS/MS平台的重要组成部分,也需兼具灵敏度、稳健性和易用性。丹麦Evosep公司在2017年发布的Evosep One液相,具有通量高、标准化、样本残留低等优点,不失为大队列及临床应用的不错选择。

 

01 Evosep One与FAIMS-Orbitrap Exploris™ 480联用


FAIMS Pro搭载Orbitrap Exploris质谱仪,为简化操作而设计,在仪器生产率和耐用性方面树立了新标准。在Orbitrap Exploris 480联合FAIMS Pro的第一篇性能评测文章中[1],Jesper V. Olsen教授就使用了Evosep One短梯度高通量蛋白组学分离系统,如图1,单个FAIMS CV电压下,上样500ng Hela 肽段,配合21分钟短梯度(每天可分析60个样品),FAIMS-DDA方法可鉴定3473个蛋白,FAIMS-DIA方法定量超过5000个蛋白。

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 图1. Evosep One液相与FAIMS-Orbitrap Exploris™ 480联用评测结果。500ng hela酶解肽段的蛋白鉴定数。A. 21min DDA/ FAIMS-DDA的结果; B. 21min DIA/ FAIMS-DIA的结果。(点击查看大图)

 

 

02 Evosep-FAIMS Pro-Exploris 480助力FFPE蛋白质组学研究


很明显,Evosep One LC与Orbitrap质谱已然成为一种成功的组合。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品是医院大量复杂组织样本的常用储存方式,可以在室温下长时间保持样本的原始形态,也是疾病研究的重要资源。鉴于样本量巨大以及样品的复杂性,需要在蛋白组覆盖深度和整体的分析时长之间找到合理的平衡点。如图2A,慕尼黑工业大学的Bernhard Kuster教授团队评估了前处理方式nanoLC、FAIMS Pro及质谱方法等多个因素[2]。数据显示,当使用44min(30SPD)或88min(15SPD)方法,上样量为600ng时,蛋白和肽段检测量几乎达到饱和(图2B、2C)。

根据优化后的方法,如图2D,作者控制总检测时长一致,其中一个样品经offline High-pH RP分级成4个馏分后使用Exploris 480进行44min的检测,另一样品组合FAIMS-Exploris 480的不同CV值分析(每次运行5个CV,总共10个CV),两种方式分别从相同的样品中鉴定到5368和5247个蛋白,且90% 蛋白质的变异系数均≤15%(图2E)。这表明样品前处理更加简洁的Evosep One−FAIMS − MS/MS分析方式可以获得与bRP分级相似的蛋白质组学深度和定量重现性。

2.png图2. FFPE蛋白质组学工作流程示意图(A); 上样量对应的蛋白(B)和肽段(C)鉴定数目; Evosep One−FAIMS − MS/MS分析方式可以获得与bRP分级的鉴定深度(D)和定量重现性(E)。(点击查看大图)

 

03 Evosep-FAIMS Pro-Exploris 480实测结果


Label free定量和DIA技术是目前运用最广泛的两种蛋白质组学研究策略,拥有一个更高效的解析平台尤为重要。FAIMS Pro – Exploris 480超高分辨质谱经近几年的市场检验,在LFQ、TMT和DIA定量工作及修饰样品等工作中都有着优异的表现。如图3,近期我们采用FAIMS Pro-Orbitrap Exploris 480平台,结合Evosep One液相及Evosep One色谱柱,对500ng Hela酶解肽段进行了15min (60SPD)或44min (30 SPD)的快速分析。

3.png图3. 测试所用的设备及色谱柱

(点击查看大图)

 

结果如图4所示,FAIMS-DDA采集模式下,采用Proteome Discoverer中2-stage SequestHT的方式对每个数据单独检索(不使用Match Between Run),15min和44min内可分别鉴定到超3500个及5100个蛋白;在FAIMS-DIA采集方式下,使用Spectronaut的direct-DIA检索方式,15min和44min内可分别鉴定到约4200个及5500个蛋白,可实现蛋白质组的快速深度分析。

4.png图4. 使用 DDA及FAIMS-DDA在不同梯度长度下从 500ng hela样品中鉴定的蛋白数(A)和肽段数(B); 使用 DIA及FAIMS-DIA在不同梯度长度下从 500ng hela样品中鉴定的蛋白数(C)和肽段数(D)。(点击查看大图)

 

总结:


全球顶尖的Orbitrap Exploris™ 480超高分辨质谱凭借其优越的分析性能,提供超高分辨率、灵敏度和稳定性,为组学研究者提供最强有力的可靠结果。Evosep One稳定的前端色谱分离技术,标准化的操作流程,能够实现全平台更高效、更稳定的蛋白质组学深度解析,满足大规模临床样本等的高强度检测需求。

 

致谢:感谢杭州纽蓝科技有限公司(Evosep大中华区总代理)在本次数据测试中提供的样机和相关技术支持

 

参考文献:

[1]. Dorte B. Bekker-Jensen , et al., A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Interface Improves Proteome Coverage in Short LC Gradients. Molecular & Cellular Proteomics, 2020, 19, 716–729

[2]. Stephan Eckert , et al., Evaluation of Disposable Trap Column nanoLC−FAIMS−MS/MS for the Proteomic Analysis of FFPE Tissue. J. Proteome Res. 2021, 20, 5402−5411

 

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@dongdan 

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