应用总结：基于Orbitrap超高分辨质谱在生物技术药物研发和质量控制中的应用

技术专家 · ‎10-15-2022

生物技术药物是指采用DNA重组技术或其他创新生物技术生产的治疗药物，主要分为重组蛋白类药物包括细胞因子类、抗体类、融合蛋白类、激素类、酶类、治疗性蛋白疫苗，及其他生物技术药物包括基因治疗和细胞治疗[1]。

近十年来，国内外生物技术药物无论在技术还是上市产品方面都取得了迅猛的发展。在创新生物技术药物研发过程中，质量控制和质量标准研究是保证其安全有效、顺利通过审评审批并成功上市的重要环节。

在重组蛋白类药物研发和质量控制中，高分辨质谱在其理化性质的鉴定中成为必备的分析方法。赛默飞独家的专利技术Orbitrap超高分辨质谱因其优异的性能在蛋白分析科研领域独居鳌头，在重组蛋白类药物领域拥有全面的解决方案包括样品前处理、数据采集及解析的详细教程（图1），加速新药的发现、开发和质量控制进程，实现高效产出。

图1.以单抗药物为例，Orbitrap超高分辨质谱在重组蛋白药物领域全面的解决方案（点击查看大图）

在重组蛋白药物研发阶段，Orbitrap超高分辨质谱主要应用于：

重组蛋白类药物表征分析

一级结构分析：分子量测定

通过实测值和理论值的比较，初步判断药物序列是否正确。经过大量的实验对比，基于Orbitrap超高分辨质谱测得的分子量更接近实际值，且能够准确分辨质量相近的成分（图2文献示例）[2,3]，以更加可信严格的标准表征重组蛋白。

图2.基于Orbitrap超高分辨质谱测定重组蛋白完整分子量的文献示例（点击查看大图）

一级结构分析：肽图分析

重组蛋白类药物的氨基酸序列是其生物活性、临床疗效的物质基础，确保序列与预期一致是首要条件。且氨基酸的翻译后修饰可能会影响其亲和力和生物学活性，鉴定修饰的类型和位置可作为重组蛋白类药物CQA评定的重要指标。通过Orbitrap超高分辨质谱仪能够获得多肽的一级精确质量和丰富的二级碎片信息（如图3），为重组药物的氨基酸和翻译后修饰表征提供强有力的支撑。

图3.针对低含量的翻译后修饰，Orbitrap依然能够获得一级精确质量和二级丰富的碎片离子（点击查看大图）

一级结构分析：糖型分析

糖基化对重组蛋白药物的疗效、稳定性、免疫原性具有重要的影响。面对结构极为复杂的寡糖，赛默飞集结优势产品解决这一难题，如图4所示，方案一为经典的LC-MS分析流程，释放糖链，糖链标记，荧光对糖链进行定量，高分辨质谱进行糖链结构鉴定。已有研究表明2AB标记的过程中会导致脱唾液酸化[4]，因此经典方法并不非常适合高含量唾液酸的糖型定量。方案二IC-MS联用则无需糖型衍生化复杂的样品前处理过程，实现对未衍生化糖型的直接定量和定性，减少样品在标记过程中唾液酸的降解。

方案一：游离糖型LC-MS分析完整解决方案

方案二：游离糖型IC-MS分析完整解决方案

图4.基于LC-MS/MS，IC-MS/MS联用分析游离糖型的完整解决方案（点击查看大图）

高级结构分析：氢氘交换质谱法(HDX-MS)

如图5该方案的优势在于对样品的要求比较低，不需要结晶，溶液状态即可；对缓冲盐，辅料等干扰物质的容忍性比较高；可以保证蛋白或者蛋白复合物在天然非变性状态下进行测定；能够实现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息，使得最终的蛋白质高级结构的信息更加全面和准确。

图5.氢氘交换质谱法完整解决方案（点击查看大图）

重组蛋白类药物宿主细胞残留蛋白（HCPs）分析

HCPs的存在主要影响药物的安全性和有效性，随着蛋白质组学技术的飞速发展，基于Orbitrap高灵敏度和宽的动态范围，可实现对未知HCPs的高通量定性和定量。与金标准ELISA相比开发周期更短，兼顾定性和定量，图6为针对极低含量HCPs的完整解决方案。

图6.基于LC-MS/MS方法对低含量的HCPs进行准确的定性和定量（点击查看大图）

基于LC-MS和LC-MS/MS对重组蛋白类药物的生物分析

对于大分子的重组蛋白类药物而言，基于LC-MS和LC-MS/MS方法相比于金标准LigandBindingAssays具有同时定性和定量、高特异性、开发周期短的优势。而Orbitrap超高分辨质谱与高端低分辨的三重四极杆相比，除具有可媲美的定量能力外，能够监测重组蛋白药物体内生物转化的优势。针对重组蛋白类药物完整蛋白水平和多肽水平定量的完整解决方案如图7，其定量限和线性范围远高于实际需求。

图7.基于LC-MS和LC-MS/MS对重组蛋白类药物生物分析的完整解决方案（点击查看大图）

高分辨质谱用于重组蛋白类药物的生产质量控制阶段（QC）

ASMS2019赛默飞正式发布了基于Orbitrap超高分辨质谱平台的多质量属性监测方法工作流程（HRMAM）如图8A，旨在监测生产过程中的关键质量属性（CQA），同时能够对未知组分检测。如图8B该解决方案的优势在于一套方案能够实现多种传统分析方法检测结果，真正的化繁为简。目前制药巨头已将HRMAM用于质量控制阶段，以及美国FDA最近在AC上发表对MAM方法的评估如图8C，极大推进高分辨质谱用于重组蛋白类药物在生产质量控制实际应用的进程。