关键词：
Orbitrap Fusion Lumos，Q Exactive HF-X，U3000 RSLCnano，纳升液相色谱柱
前言
蛋白质组学是对蛋白质的结构和功能的大规模研究。目前，基于质谱的方法已经被广泛地应用于蛋白质组学中。在目前的蛋白质组学分析策略中，主要采用纳升级液相色谱，为蛋白质组学研究用户提供更高的灵敏度，而且可以更轻松地与质谱连接， 同时还大幅降低了样品和溶剂的消耗量。这不但补偿了延长的操作时间，还降低了操作成本。为了获得高质量的原始数据，不仅需要超高分辨、超高灵敏度、超高质量精度的质谱仪
器，还与优异的色谱条件密不可分。想要获得更为出色的原始谱图，需要选择最佳、稳定的色谱柱予以支持。
与纳升级液相匹配使用的纳升级色谱柱有商品化的，也有自制一体毛细管柱。在本工作中，我们采用Orbitrap超高分辨质谱与U3000 RSLCnano液相联用，使用源自细胞的肽段样品对赛默飞不同规格的商品化纳升色谱预柱和分析柱进行测评研究。后又使用不同批次的纳升色谱柱进行重现性测试。
实验方法
1. 样品前处理
对人源293T细胞使用FASP方法酶解，并使用Pierce QuantitativeColorimetric Peptide Assay试剂盒进行肽段定量，酶解后的肽段使用A液（0.1% FA，H2O）复溶， Orbitrap Fusion Lumos对样本进行LC-MS定性分析。
2. 色谱方法
高效液相色谱：Thermo Scientific Ultimate 3000 RSLCnano；
流动相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid inAcetonitrile；
色谱梯度：65min
流速：300 nL/min
3. 质谱条件
质谱仪：Orbitrap Fusion Lumos
通用设置：喷雾电压：2.2 kV；毛细管温度：320℃；FunnelRF：40% ；APD：True；Scan range 350-1500 m/z；数据采集模式：Top Speed；Cycle time：3s；Dynamic exclusiontime：30s；极性：positive；Include charge state(s) = 2-7
MS OT：分辨率：60,000@m/z 200，Max IT：20ms；AGC Target = 400,000；Microscans = 1；
MS2 OT：Isolation Mode = Quadrupole；Isolation Window = 1.6Da；分辨率：30,000@m/z 200；Max IT：30ms；AGC Target= 50,000；HCD，Collision Energy (%) = 30；FirstMass = 110；Microscans = 1
质谱仪：Q Exactive HF-X
通用设置：喷雾电压：2.1 kV；毛细管温度：320 ℃；FunnelRF：40% ； Scan range 350-1500 m/z；数据采集模式：Top20； Dynamic exclusion time：30s；极性：positive；Include charge state(s) = 2-7
MS OT：分辨率：60,000@m/z 200，Max IT：20ms；AGC Target = 3,000,000；Microscans = 1；
MS2 OT： Isolation Window = 1.6 Da；分辨率：15,000@m/z200；Max IT：45ms；AGC Target = 50,000；HCD，CollisionEnergy (%) = 27；FirstMass = 110； Microscans = 1
4. 数据处理
原始文件（raw le）使用 Proteome Discoverer 2.3 软件搜索Swissprot_Human 数据库，Precursor Mass Tolerance设为10ppm，Fragment Mass Tolerance设为0.02Da，修饰设为Oxidation（+15.995Da）、Acetyl（+42.011Da）和Carbamidomethyl（57.021Da），检索结果通过严格标准进行筛选（PSM FDR < 1%, peptide FDR < 1%）。
实验结果和讨论
U3000 RSLCnano 具有两套泵系统，二元高压梯度纳升泵，三元低压梯度微升泵，上样速度快，系统用nanoviper接头，死体积小，最高耐压860bar（纳升梯度泵）。色谱柱不仅需具有优异的柱效、提高灵敏度，还需具备完美的重现性，为蛋白质组学研究者提供更为可靠的数据支持。Nano Viper商品化纳升色谱柱更轻松地与液相、质谱连接（如下图1）。Orbitrap FusionLumos和Q Exactive HF-X是两款高分辨率、高精度、高灵敏度的质谱仪，均使用高容量离子传输管（HCTT）和电动离子漏斗（EDIF），具备更高的灵敏度；三段式的四极杆，提升离子的选择和传输效率。
图1 分析柱和补集柱在纳升离子源和U3000 RSLCnano液相色谱中的连接方式
1. 补集柱分析测评
65min梯度不同补集柱和不同分析柱组合在Orbitrap Fusion Lumos – U3000 RSLCnano系统中，所鉴定到的蛋白和肽段（三次取均值）如下图2A、2B所示。测评不仅考察了不同组合色谱柱在相同液相-质谱系统中的蛋白/肽段鉴定量，还考察了不同组合色谱柱峰宽柱效，如图2C，不同色谱柱鉴定的肽段总强度见图2D
由上图实验结果可知，在相同分析柱的条件下，两款不同的补集柱164946和164564，在蛋白鉴定量、肽段鉴定数目以及峰宽、总肽段强度的条件下，使用164946柱效明显优于164564。补集柱164564用于300nL/min的流速时，死体积很大，峰太宽，导致蛋白/肽段鉴定量较低，主要原因是164564补集柱内径为100 µm，C18为5µm颗粒，可用于毛细管级流速的应用，峰宽合适、通量高；
2. 分析柱分析测评
由以上数据结果可知，在相同补集柱的条件下，分析柱164941/164940柱效较好，峰宽合适，蛋白/肽段鉴定量较高。164940为15cm，164941为25cm，考虑到方法梯度，若短梯度用户可考虑使用164940分析柱。而164562和164568两款分析柱，无论连接哪个补集柱，峰都较宽，柱效不好，鉴定量较低，不推荐使用。
3. 使用不同批次的纳升色谱柱进行重现性测试
对于测评结果，补集柱164946和分析柱164941的柱效性能较佳，为了测试该组合色谱住校的重现性，使用不同批次164946补集柱和164941分析柱还在不同的Q Exactive HF-X仪器中进行测评，如下图所示。
图3三款不同仪器不同批次补集柱164946+分析柱164941的BPC图和 XIC图
同样，使用不同仪器不同色谱柱所得结果，峰形、出峰时间、峰宽、保留时间上都保证了色谱柱的稳定性，此三款仪器120分钟梯度色谱峰宽在40s左右，并且Delta RT仅为1.2min左右，不同批次间重现性非常好。
结论
由以上测评工作可以看出，两款商品化补集柱164946和分析柱164941色谱柱组合不仅具有优异的柱效、提高了灵敏度，还表现出完美的重现性，为蛋白质组学研究者提供更为可靠的数据支持。而且通过nanoviper更轻松地与液相、质谱连接，使纳升色谱柱的耐用性、通量和易用性之间达到完美平衡。
仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。
Thermo Fisher Scientific
United States
