关键词：
血浆，蛋白质组学，生物标志物，精准医学
前言
血液是最重要的临床检验样品来源。基于质谱的蛋白质组学可在几小时内定量几百个血浆蛋白，是研究血液生物标志物的主要方法之一。但由于血浆蛋白的动态范围极高，从血浆中鉴定蛋白的数量通常比较有限（200-300种），进行深度蛋白解析（>500种蛋白）往往还需进行繁琐的分级，影响了研究的通量和重现性。因此，我们利用Orbitrap Fusion Lumos质谱极佳的灵敏度和稳定性，发展了一种快速、稳定的高通量血浆蛋白质组研究策略。去除血浆中的高丰度蛋白后，进行Lys-C和trypsin串联酶解，再采用96孔固相萃取板进行高通量固相萃取。通过单针DIA数据采集，仅用1小时梯度即可定量700种蛋白，2.5小时梯度可定量超过1000种蛋白。
实验条件
实验材料和方法
血浆样品经High-Select™ Top14 Abundant Protein Depletion Resin（PN A36369）或Pierce™ Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns （PN 85165）去除高丰度蛋白后，加入8M盐酸胍溶液变性，还原烷基化之后，进行Lys-C和trypsin串联酶解。采用SOLAµ HRP 96-well plate （PN 60209-001）进行固相萃取除盐。具体处理流程如下图1。
图1. 高通量血浆蛋白质组酶解流程
纳升液相色谱质谱联用（nano LC-MS）
高效液相色谱仪：Thermo Scientific Easy-nLC 1200；色谱柱：analytical column（C18， 75 μm x 25 cm，2 μm，PN164941），pre-column （C18，75 μm x 2 cm， 3 μm，PN164946）；流动相：A：0.1% Formic acid in water；B：0.1%Formic acid in 80% acetonitrile；梯度：3%-8% B in 4 min，8%-32% B in 133 min，32%-100% B in 10 min，100% B 3 min；流速：300 nL/min
质谱仪：Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos；喷雾电压：2.0 kV；毛细管温度：300 °C；碰撞能量：30% HCD；分辨率设置：一级120,000@m/z 200，二级15,000@m/z 200；Max IT ：full MS 50 ms，full MS/MS 60 ms；母离子扫描范围：m/z 350-1500；子离子扫描范围：start from m/z 130；Data-dependent MS/MS：cycle time 3 s；Isolation window：1.6Da；dynamic exclusion：40 s。
采用Spectronaut软件（11.0.15038.20.25720）对质谱数据进行非数据依赖（DIA）定量。peptide FDR<0.01； protein FDR<0.01。
实验结果
1 深度覆盖血浆蛋白质组谱图库的建立
为建立高通量和稳定的血浆蛋白质组分析流程，我们首先测试了三种深度覆盖血浆蛋白质组谱图库的建立方式（图2）。通过去除高丰度蛋白和高pH反相色谱分级，我们成功获得了深度覆盖的血浆蛋白质组谱图库（图2AB），与已发表的文献[1],[2]相比，我们获得了对血浆蛋白质覆盖程度最高的谱图库（图2C）。
图2. 深度覆盖血浆蛋白质组谱图库的建立。A：三种建立血浆蛋白质组谱图库的策略：1.直接酶解；2.去除高丰度蛋白后酶解；3.去除高丰度蛋白并酶解后，经高pH反相色谱分为30个馏分，对每个馏分进行液质联用分析。B：三种策略建立谱图库的比较。C：本工作建立的谱图库与已发表文献的比较。
2 稳定的高通量血浆蛋白质组前处理策略
精准医学研究中的分析对象通常是临床样本队列，其样品数量较多。因此，分析方法需要具有较高的通量以及良好的重现性。经过高丰度蛋白去除后的血浆或血清样品，蛋白溶液体积相对较大（~500 μL）。通常采用超滤法（FASP）富集并酶解，但FASP耗时长、回收率较低、重现性不佳。为提高血浆样品前处理的通量和稳定性，我们设计了简化的样品处理流程，不使用超滤管，直接加入8M盐酸胍溶液使蛋白变性，还原烷基化之后，采用Lys-C和trypsin两步串联酶解。使用96孔板进行后续多肽脱盐（图1）。这一酶解策略的全部步骤都可在96孔板中进行，从而极大提高了前处理的通量。
在前处理策略的开发中，我们发现采用Lys-C和trypsin两步串联酶解可显著提高酶解的回收率，得到更多种类的多肽，并显著减少了酶解肽段中的漏切比例（图3）。
图3. Lys-C和trypsin两步串联酶解与单独使用trypsin酶解的效果对比
我们采用技术重复和生物重复对完整的前处理流程进行评估。技术重复的蛋白中位CV小于20%（图4），证实前处理策略具有良好的重现性。采用本工作流处理的样品在Orbitrap FusionLumos质谱上进行液质联用分析，一小时可定量超过700个血浆蛋白，2.5小时可定量超过1000个血浆蛋白。
图4.技术重复（起始样品为同一份混合后血浆，等分后进行完整前处理流程，n=9）和生物重复（起始样品为不同人的血浆，n=5）的蛋白定量CV分布。
3 应用高通量血浆蛋白质组分析策略研究骨髓增生异常综合征（MDS）的血浆生物标志物
我们应用本策略研究了骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）病例的血浆样本。筛选在不同分组中蛋白变化倍数（fold change）大于2倍，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白，四组样品中共定量86种差异蛋白，这些蛋白即为血浆样品中的潜在生物标志物。
图5. A.四组MDS相关的血浆样品的差异蛋白质热图。B. 差异蛋白可聚类为六组。
结论
血液是最重要的临床检验样品来源。精准医学研究中的大队列生物标志物研究对于分析方法提出了高通量和高稳定性的要求，利用Orbitrap Fusion Lumos质谱极佳的灵敏度和稳定性，我们发展了一种快速、稳定的高通量血浆蛋白质组研究策略。简化的前处理步骤通量高、稳定性好，仅用1小时梯度即可定量700种蛋白，2.5小时梯度可定量超过1000种蛋白。基于高通量的深度血浆蛋白质组解析，我们可从大规模临床队列中发现潜在的生物标志物，助力精准医学研究。
参考文献
[1] Keshishian, H. et al. Mol Cell Proteomics 14, 2375-2393.
[2] Liu, C. W. et al. J Proteomics 152, 321-328
Thermo Fisher Scientific
United States
