融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与其他天然蛋白（融合伴侣）融合而产生的新型蛋白。功能蛋白分子通常是内源性配体（或相应受体），如细胞因子、生长因子、激素和酶等活性物质，融合伴侣主要有免疫球蛋白、白蛋白和转铁蛋白等。
融合蛋白有两点主要作用：
一是提高功能蛋白的稳定性、延长在体内的代谢时间；二是融合一个或多个功能片段，形成高效靶向药物。
其中抗体Fc融合蛋白应用最多，与Fc融合的功能蛋白分子可以分为4大类：A)天然受体的胞外结构域（如依那西普、贝拉西普和阿巴西普）;B) 新型结合域，如活性肽（如罗米司亭、度拉糖肽）；C)细胞因子诱捕（如阿柏西普、康柏西普）；D)重组酶类（如阿糖酸酶α、efmoroctocogα ），如下图所示1。
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与单抗药物相比，融合蛋白一般含有多个N糖基化位点并且在功能蛋白上含有O糖基化位点（如上图所示），导致其异质性高，使得融合蛋白的表征更具有挑战性。这些寡糖包含双、三、四天线的寡糖结构。这些复杂糖基化结构可以通过如唾液酸含量变化和末端N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基对Fc融合蛋白的体内清除产生显著的影响。由于糖基化修饰的深远影响，进行全面的和位点特异性的糖基化分析是Fc融合蛋白质量控制中至关重要的一环。
Fc融合蛋白的结构复杂性和异质性需要多种分析工具来全面的表征,如离子交换色谱（IEX）、等电聚焦电泳（IEF）、成像毛细管等电聚焦电泳（icIEF）、疏水作用色谱法（HIC）、RP-LC、尺寸排阻色谱（SEC）和LC-MS等。Orbitrap高分辨质谱由于其高灵敏度、高分辨率和高质量精度可以很好的对融合蛋白一级结构进行确认，能够在完整蛋白、糖肽和游离糖层面对融合蛋白糖基化修饰进行深度和全面的表征。
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完整蛋白分析
完整蛋白分析是一种简单快速的既可以揭示治疗蛋白的异质性，也可以比较样品间的分子量的方法。然而，由于融合蛋白的高度异质性，特别是由于多个N-和O-糖基化位点的存在，使得直接测定完整分子量存在挑战，分析策略为在完整蛋白水平上降低复杂性。一般可以用相关酶切除融合蛋白上的N糖或液酸酶,也可以将其还原或者用IdeS蛋白酶将其酶切成亚基，降低蛋白的复杂性再进行检测，实验流程图如下图所示。
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以融合蛋白依那西普为例，其含有6个N糖基化修饰位点和26个O糖基化修饰位点，异质性非常高，从而无法直接测到完整分子量。采用脱糖降低其复杂性的策略从而测得其脱糖完整分子量。依那西普用PNGaseF和α2-3,6,8,9Neuraminidase切去N糖和O糖上的唾液酸或用PNGaseF, α2-3,6,8,9 Neuraminidase, β-(1-4)-Galactosidase,β-N-Acetylhexosaminisase和O-Glycosidase组合使用切去N糖和O糖，得到的脱糖样品用UHPLC-Q Exactive高分辨质谱仪检测，用Biopharma Finder软件对采集的数据去卷积分析。Q Exactive测得依那西普脱N糖和O糖上的唾液酸样品的质谱图(下图A)和脱N糖和O糖样品的质谱图(下图B)信噪比高、基线干净、电荷分布均匀、质谱峰基线分离，Biopharma Finder软件自动匹配到脱糖完整分子量的O糖基化修饰状态，脱N糖和O糖上的唾液酸样品的去卷积分子量主要依那西普含17~21HexNAcHexO糖基化修饰的形式(下图A)，脱N糖和O糖样品的去卷积分子量能鉴定到依那西普裸蛋白的分子量和存在1~2HexNAcHexO糖基化修饰的形式，可能是脱O糖不完全所导致。通过脱糖的策略能在依那西普完整分子量水平确定蛋白序列是否正确以及O糖基化翻译后修饰的情况。
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糖肽分析
融合蛋白由于包含多个N糖基化位点和O糖基化位点导致在完整蛋白层面上很难得到全面的糖基化信息，可以将其用蛋白酶酶切获得肽段后再在糖肽的水平对其进行鉴定，糖肽鉴定的实验流程如下图所示。N糖基化的天冬酰胺位点必须处于NXS/T序列子,其中X可以是脯氨酸以外的任何氨基酸，N-糖链都有一个由3个甘露糖（Man）和2个N-乙酰胺葡萄糖（GlcNAc）组成的分支的五糖核心。
O糖基化能发生在丝氨酸S和苏氨酸T上，O-糖链的结构远比N-糖链多样而复杂，已发现至少有8种不同的核心结构，其鉴定难度远远高于N糖基化的鉴定。对于融合蛋白而言，N糖肽的鉴定难度不大，质谱可以鉴定到N糖肽的位点信息、糖基化修饰类型以及比例。对于O糖肽位点的鉴定需要更高级的碎裂模式电子转移解离（ETD）或者借助于样品前处理间接的进行鉴定。
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以依那西普为例，首先进行蛋白序列覆盖率和N糖肽的鉴定。用Trypsin和AspN联合酶切获得肽段，联合酶切的目的是使获得得每条N糖肽上只有一个糖基化位点，然后用Q Exactive高分辨质谱在高能碰撞解离（HCD）模式下对N糖肽进行鉴定，Biopharma Finder软件对数据分析即可得到N糖肽位点、糖基化修饰类型和比例。依那西普在这一次肽图实验中即可以达到100%的序列覆盖率（如下图所示），结合脱糖完整分子量信息，可以对其蛋白序列确证，表明蛋白氨基酸序列正确。
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依那西普由两条对称的链组成，通过二硫键连接，每条链上有3个N糖基化修饰和13个O糖基化修饰。在本次实验中3个N糖基化修饰均鉴定到，修饰位点分别为N149、N171和N317，每个位点N糖基化种类和修饰比例如下图所示，图中的数字代表某糖型修饰的百分比。
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由于O糖肽的鉴定比N糖肽更具有挑战，所以在分析策略上我们可以在样品前处理时将样品进行简化和用更高端的Orbitrap质谱仪。在样品前处理中可以通过切除N糖和唾液酸降低样品的复杂性，也可以进一步用TMT标记O糖肽以提高质谱的响应。使用ETD碎裂模式可以保留含完整糖修饰的肽碎片，从而对其位点进行鉴定。
以依那西普O糖肽的鉴定为例，样品用Trypsin酶切和用唾液酶对O糖肽脱唾液酸，再用TMT标记试剂进行标记，获得TMT标记的O糖肽，Orbitrap Fusion三合一质谱对TMT标记的O糖肽进行检测，13个O糖基化位点均鉴定到。下图为一条肽段上包含7个O糖基化修饰位点的EThcD碎裂的二级谱图，EThcD是将糖肽首先用ETD碎裂然后再将碎片离子用HCD进一步碎裂从而在一张二级谱图里面同时获得丰富的b,y和c,z离子，通过特征碎片离子能将各个O糖基化位点都鉴定出来，确保鉴定结果的可信可靠。
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如果质谱没有ETD碎裂模式又需要对O糖肽进行鉴定，我们也可以参考Yangetal(2018)发表的文献方法，通过间接的方法对O糖肽鉴定4。蛋白质首先被酶切成肽段，肽再结合到固体的载体上，再用OpeRATOR蛋白内切酶酶切将O糖肽从载体上释放洗脱下来，获得O糖肽。OpeRATOR蛋白内切酶可以特异性酶切O糖基化修饰的S和T，从而得到肽段N端以S或T开头的O糖肽，Q Exactive高分辨质谱仪在HCD模式下即可将O糖肽鉴定出来，实验流程如下图所示。
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游离糖链分析
游离糖链分析也是蛋白类生物制品表征中不可缺少的一项，N糖链的实验流程为用糖苷内切酶PNGase F将N糖链释放，再进行荧光试剂的标记，可以用荧光和质谱进行检测，实验流程如下图所示。
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与单抗N游离糖相比，融合蛋白的N游离糖糖型更复杂，种类多且可能含有较高比例得唾液酸修饰，选择合适的色谱柱进行分离相当重要。Thermo专门为寡糖分离设计了GlycanPacAXH-1/AXR-1色谱柱，结合了弱阴离子交换WAX和亲水相互作用HILIC(AXH-1)/反相RP(AXR-1)两种保留机理，能够高效率地分析复杂寡糖链混合样本。经典的HILIC/RP机理可以根据电荷数、极性、大小实现寡糖链分离，而WAX机理保留和选择带负电荷的寡糖链，对含唾液酸的寡糖链具有很好的分离效果。Thermo Scientific™ GlycanPac™ AXH-1, Thermo Scientific™ GlycanPac™ AXR-1, Thermo Scientific™ Accuore™ 150-Amide-HILIC均可用于游离糖的分析，可以根据样品的复杂程度进行选择适合样品的色谱柱，各色谱柱的分离效果见下图所示。
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与N糖链分析相比，O糖没有特异性的内切酶能将其从蛋白上释放，只能通过化学法去糖基。以依那西普O糖链分析为例，样品前处理使用BlotGlycoTM O-Glycan样品制备试剂盒。实验步骤主要分2步，第一步将O型糖链从糖蛋白上释放下来，而N糖型不受到本试剂影响而分离。第二步为O型糖链的纯化和2AB标记，操作步骤流程图见下图。
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使用Thermo GlycanPac AXH色谱柱进行分离2AB标记的依那西普O-糖链，同时用荧光检测器和QExactive高分辨质谱仪进行检测。本次实验鉴定到3种2AB标记的依那西普O-糖链，对应的糖型为（Hex1）(NeuAc1)，（Hex1）(NexNAc1)(NeuAc1)和（Hex1）(NexNAc1)(NeuAc2)，其中（Hex1）(NeuAc1)为解离产物，根据荧光的强度计算的三种糖型所占的比例分别为35.4%，54.0%和10.6%。质谱测得结果中各糖型测得质量与理论质量相比，质量偏差都在3ppm以内。鉴定到的O-糖链的详细信息见下表。
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2AB标记后O-糖链可以用荧光检测器进行检测并且能够增强其质谱的信号响应，2AB标记的依那西普O-糖链的荧光色谱图和（Hex1）(NeuAc1)，（Hex1）(NexNAc1)(NeuAc1)和（Hex1）(NexNAc1)(NeuAc2)糖链的提取离子质谱图见下图。
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二硫键分析
融合蛋白除了含有多个N糖基化和O糖基化位点带来巨大的表征难度外，有些融合蛋白还有复杂的二硫键连接，如二硫键相互嵌套、单种酶切没有酶切位点等，融合蛋白复杂二硫键的表征也是非常具有挑战的。然而，二硫键对于蛋白质三级结构的正确形成和维持起到重要的作用，对于蛋白质功能的正常发挥也有重大影响。二硫键是影响药物安全性和有效性的重要属性，也是蛋白药物结构表征和质控的关键环节之一。
以依那西普为例，其二硫键鉴定的难点有二：
01：
依那西普含有多个糖基化位点，并且每个位点又含有多种糖基化翻译后修饰，糖基化修饰的肽段离子化效率会受到抑制导致质谱响应降低，如果糖基化发生在二硫键连接的肽段上，可能会导致该二硫键鉴定不到。
02：
依那西普复杂的二硫键连接方式，如二硫键相互嵌套和在一条二硫键肽段中同时存在多对二硫键，难以对二级碎片进行归属。
为了克服这两难点，我们通过样品前处理减少二硫键的复杂程度，从而将依那西普的全部二硫键鉴定出来。首先用PNGase F糖苷内切酶和唾液酸酶脱掉依那西普上的N糖和O糖上的唾液酸，降低糖基化给样品带来的异质性。样品前处理可能会带来二硫键的错配，有效降低样品前处理过程中带来二硫键错配的方法是样品前处理需要在偏酸性条件下进行并且对游离半胱氨酸用NEM封闭。为了降低一条二硫键肽段中二硫键的复杂性，本实验用Trypsin、chymotrypsin和AspN3种酶混合酶切，使得二硫键连接肽段尽可能简单。最后将样品分成两部分，一部分用于二硫键分析，另一部分还原烷基化后肽图分析用于对照，可减少假阳性结果，实验步骤流程图见下图。
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使用Thermo BioPharma Finder 软件对Q Exactive高分辨质谱采集的依那西普混合酶酶切肽段的质谱数据进行分析，由于依那西普为对称的两条相同的链通过Cys240-Cys240, Cys246-Cys246, Cys249-Cys249 3对链间二硫键连接在一起，单条链上有Cys18-Cys31,Cys32-Cys45,Cys35-Cys53,Cys56-Cys71,Cys74-Cys88,Cys78-Cys-96,Cys98-Cys115,Cys104-Cys112,Cys121-Cys139,Cys142-Cys157,Cys163-Cys178,Cys281-Cys341,Cys387-Cys445 13对链内二硫键，两条链链内二硫键是相同的，所以只需鉴定到16个二硫键即覆盖依那西普所有的29个二硫键。Q Exactive鉴定到的12个二硫键结果中，包含4个双二硫键（2SS）和8个单二硫键（1SS），覆盖了依那西普所有的二硫键。混合酶切使得二硫键肽段最大程度简化，使得每个二硫键结果的各条肽段碎片离子更好进行归属，但混合酶切也会导致酶的肽段比较碎，鉴定结果中肽段长度不同，所以同一个二硫键会对应到多个鉴定结果，下表中给出了每个二硫键鉴定结果中强度最高的二硫键结果。
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我们的二硫键解决方案基于三点进行鉴定：
（1）在还原样品中，该二硫键肽段的强度远远小于非还原样品;
（2）测得一级分子量与理论分子量相比，质量偏差小于5ppm;
（3）所有鉴定到的二硫键均含有二级谱图。
只有满足以上3条才认为鉴定的二硫键结果可信，从而保证数据的可信可靠。以C18-C31，C32-C45双二硫键为例，下图a为其一级质谱图，与理论分子量相比质量偏差为0ppm。下图b为Thermo BioPharma Finder软件对该双二硫键二级谱图的匹配，由于该二硫键含有3条肽段，软件将同一张二级谱图分别将3条肽段b,y离子标记出来，方便碎片离子归属。
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综上所述，融合蛋白由于其包含多个N糖基化和O糖基化修饰位点导致样品异质性非常高，对其表征带来巨大的挑战。Orbitrap高分辨质谱能对融合蛋白在完整蛋白糖型、N糖肽和O糖肽、游离N糖链和游离O糖链以及复杂二硫键进行深度和全面的表征，Thermo从样品前处理、LC-MS方法到数据分析有一整套完整的解决方案。
参考资料
1.Bastiaan L. Duivelshof, et al. Therapeutic Fc-fusion proteins: Current analytical strategies. J Sep Sci. 2021 Jan;44(1):35-62.
2.Saba, J., et al. (2012) ‘Increasing the productivity of glycopeptides analysis by using higher-energy collision dissociation-accurate mass-product-dependent electron transfer dissociation‘, International Journal of Proteomics, 2012, (pp. 1-7)
3.Weiming Yang, et al. Mapping the O-glycoproteome using site-specific extraction of O-linked glycopeptides (EXoO). Mol Syst Biol. 2018 Nov 20;14(11):e8486.
4.Amy Farrell, et al. Evaluation of chromatographic phases for separation of differentially labeled glycans from erythropoietin and trastuzumab. Thermo AN-21739.
5.基于Q Exactive高分辨质谱仪的Enbrel O-糖链的鉴定。Thermo AN
6.UHPLC-Q Exactive高分辨质谱对融合蛋白Enbrel二硫键的表征。Thermo AN 20020.
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Thermo Fisher Scientific
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