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本周硬核知识点

治疗性寡核苷酸大多由化学合成法生产,其杂质主要有截短序列(“shortmers”)型、延长序列(“longmers”)型和全长修饰的产物。其中n-x(指5’端不完全碱基偶联产生的缺失序列)型杂质最为常见,主要由于5’端碱基偶联失败,加帽不完全导致,同时也会产生不同单个碱基缺失的n-1型杂质。延长型杂质主要是n+1或n+2类,修饰型杂质的位点主要发生在核苷酸碱基或硫代磷酸酯键。

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尽管化学修饰的寡核苷酸通常非常稳定,但不同的序列和应激源影响其降解速度,从而引入一些降解杂质。IP-RPLC-MS先进的分析方法成为表征各种含量非常低的寡核苷酸杂质和降解产物必不可少的工具。

 

本次分享赛默飞高级产品经理刘海川博士将ddMS2方法扩展到寡核苷酸杂质和降解产物的表征,及对不同纯化方法下杂质的相对定量。

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样品信息

不同纯化方法的DNA 21mer (CAG TCG ATT GTA CTG TAC TTA) 购于Integrated DNA Technologies公司(Coralville,IA, U.S.A.)。

样品A:标准脱盐纯化后产品;

样品B:HPLC纯化后产品,LC-MS进样浓度为100µg/mL。

 

★强制降解样品制备:将标准品(1mg/mL)置于80°C分别持续1,2,4和24h后,冷却至室温,稀释到100µg/mL,进行LC-MS分析。

 

★强制氧化样品制备:将标准品(1mg/mL)与5%H2O2在室温下分别孵育1,2,4,6和24h,稀释到100µg/mL,进行LC-MS分析。

 

液相设备及方法

Vanquish Horizon UHPLC系统

Thermo Scientific™ DNAPac™ RP column (4 μm, 2.1 × 50 mm, P/N088924) 色谱柱;

 

★Mobile Phase A:2%(~190 mM) HFIP and 0.1% (~5.7 mM) DIPEA in water (pH 7.8);

 

★Mobile Phase B:0.075%(~7.1 mM) HFIP and 0.0375% (~2.1 mM) DIPEA in methanol;

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图1. 液相梯度(点击查看大图)


质谱仪:Orbitrap Exploris 240

质谱方法参数设置如图2所示。

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图2A.离子源参数

 

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图2B.质谱一级全扫描参数

 

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图2C.质谱数据依赖型扫描方法参数


数据分析软件:BioPharma Finder4.0

 

实验结果

一级分子量测定

使用120K分辨率将21mer样品的单同位素峰实现基线分离(图3),且测得精确质量偏差<1ppm。(提示:为降低加盐峰,谨慎选择流动相及离子对试剂)

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图3.120K分辨率下对21mer样品实现单同位素峰的分辨,且对含量低于2%的加盐峰实现精确测定(点击查看大图)


Stepped NCE的优化

最佳的NCE取决于寡核苷酸序列、长度、修饰和电荷状态,需详细优化。图4显示使用两个不同steppedNCE对21mer的9-分子碎裂的碎片覆盖度和被注释后的MS2谱图,stepped NCE(14-16-18)较(10-12-14)获得更多的碎片离子,达到100%的碎片覆盖度。

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图4.在stepped NCE(10-12-14)(a-b)和stepped NCE(14-16-18)(c-d)碰撞能量下对21mer的9-分子碎裂,碎片覆盖图和被注释的MS2谱图(点击查看大图)


对两样品(A:标准脱盐纯化,B:HPLC纯化)的杂质进行鉴定、定位及相对定量

ddMS2方法不仅可以快速确认寡核苷酸序列和修饰位点,而且能够对色谱图中无法分辨的含量非常低的杂质进行准确定性。图5a和5b分别显示21mer样品(脱盐法和HPLC纯化)的总离子流色谱图,阴影部分表示每个样品中鉴定出的杂质。图5a插图表示n-16的选择离子流色谱图(SIC)的放大图,其含量低于0.015%,但该杂质仍可通过高可信度的MS2质谱图(图5c)和碎片离子覆盖度图(5d)来确证。

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图5.标准脱盐法(a)和HPLC法(b)纯化21mer后的总离子流色谱图,其中阴影表示寡核苷酸及鉴定出的杂质。对于丰度极低的n-16(~0.015%)杂质仍有高可信度的MS2谱图(c)及碎片离子覆盖度图(d)进行准确确证(点击查看大图)

 

此外,比较脱盐和HPLC方法纯化的两个样品的质谱峰面积及其n-x杂质丰度的百分比。在两个样品中,主成分的总面积几乎不变(图6a),但n-x杂质的丰度比却显著降低(从2.55%降至1.18%)。与脱盐样品相比经HPLC纯化的样品短链杂质含量更低(图6b,6c),对于5’末端带有磷酸盐的n-x杂质也有相似的趋势。

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图6.BioPharma Finder4.0软件针对两种不同纯化方法样品及其杂质进行精准的定性和相对定量(点击查看大图)


强制降解产物的鉴定

在体内或生理条件下DNA的降解高速发生,为详细了解合成类寡核苷酸的降解途径,酸、碱、强制氧化、热和光解等应力得到广泛的研究,本次研究热和氧化对21mer样品的影响。图7展示对样品加热时长在2-4h之间时,21mer主成分含量显著降低;6h后检测到各种长度的降解产物,24h后主成分和大片段杂质几乎完全降解。

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图7a.在80°C加热条件下,不同加热时间的总离子流色谱图(TIC);7b. 主成分的选择离子流色谱图(SIC);7c.不同时间点主成分峰面积的汇总图(点击查看大图)

 

在热应力条件下不同类型杂质的行为不同(图8),杂质n-1的相对含量随着加热时间的延长逐渐降低,杂质n-5在1h时增加,然后稳定降低,在加热24h后小片段杂质含量显著增加如n-18。但是该样品在热应力下,带有5’-PO4H的n-x型降解产物(图8b),碱基丢失产物(图8c),及去嘧啶或去嘌呤有关的杂质显著增加(图8d)。

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图8a.n-x(5’-OH)型,图8b.n-x(5’-PO4H)型,图8c.碱基丢失型,图8d.去嘌呤和去嘧啶型杂质在不同时间点下的相对含量变化(点击查看大图)

 

与热应激相反,氧化应激并未导致21mer样品的TIC发生显著变化(图9a),H2O2处理后n-x杂质含量略有增加,但随着时间的延长保持稳定(图9b),然而氧化的21mer成分升高显著。总而言之,强制降解实验展示了ddMS2在单针实验中能够鉴定和相对定量杂质的强大功能,以便于深入了解寡核苷酸降解途径。

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图9a.对照样品与5%H2O2处理后不同时间点的总离子流色谱图;9b.n-x型杂质的含量变化;9c.主成分未发生明显变化;9d.主成分的氧化含量随着时间的延长显著提高(点击查看大图)


样品中高分子量杂质解析

在脱盐纯化的样品中,检测到一系列高分子量杂质,主要在~9min被洗脱下来(图10a),有趣的是这些杂质未出现在HPLC纯化样品中(图10b),表明HPLC纯化法的有效性。在~9min处的色谱峰对应两个主要成分,图10c显示其中一个,Orbitrap Exploris240的超高分辨率能够将这些高分子量杂质进行精确的测定。经过BioPharma Finder软件的去卷积,杂质分子量与主成分相差n-x,即杂质分子量为M+(n-x)(图10d),测得质量偏差均小于1ppm(表1)。

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图10a-b.脱盐、HPLC方法纯化后样品的TIC放大图;图10c-d.高分子量杂质的原始质谱图及去卷积后的质量分布(点击查看大图)

 

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表1.高分子量杂质的质量偏差,M=21mer

 

对高分子量的杂质进行序列鉴定,图11展示M+(n-1)类型杂质的碎片离子覆盖度,该杂质通过检索41nt序列,序列分别产生于21mer的3’端加上n-1的3’端(图11a)或5’端(图11b)。21mer3’端加上n-1的3’端序列中未匹配到相应的碎片(图11a),而5’端则有一系列片段与之匹配(图11b),确证该杂质的序列。

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图11.M+3’(n-1) 和M+5’(n-1)碎片离子覆盖图(点击查看大图)

今日总结

三个案例研究证明了基于Orbitrap平台能够快速评估寡核苷酸样品的纯度,并准确鉴定各种杂质,实现对不同纯化方法及寡核苷酸杂质、降解产物的深入研究。

 

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@dongdan 

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