随着单细胞蛋白组学的发展，研究人员开始越来越关注样品前处理流程的自动化实现。今天小编给大家分享一篇预印本上的文章“An automated workflow for label-free and multiplexed single cell proteomics sample preparation at unprecedented sensitivity”，作者是来自维也纳生物中心的 Karl Mechtler 教授。
文中建立了名为proteoCHIP的单细胞蛋白组前处理平台，自动化处理部分采用了商业化的cellenONE 系统，可进行单细胞分离，皮升级分液，完成细胞裂解、酶解、TMT标记等所有前处理过程，并可用于直接LC-MS系统的上样。158个两种不同类型的单细胞分析中，可获得接近2000个蛋白鉴定，并很好区分两种不同的细胞类型。该方法可适用于非标记或标记的前处理流程。
# 样品前处理 proteoCHIP
图1 基于proteoCHIP的TMT标记单细胞蛋白组样品前处理流程（点击查看大图）
ProteoCHIP采用商业化的cellenONE系统，其大小与标准的显微镜载片类似，由两部分组成。单细胞分离和样品前处理在nanowell部分进行，其中包括12个小块可处理12个非标定量单细胞或者12组TMT标记样品，每组最多处理16个单细胞，总共192个单细胞（图1）。样品合并在funnel部分进行，TMT标记后可通过离心进行样品合并，然后直接用于LC-MS进样。
# 单细胞分离
可能有些人就会好奇了，这套系统是怎么获取单细胞的，图2中给出了详细的解释[1]。系统中使用了压电式分配毛细管，基于光学检测进行单细胞分离。含有细胞的液体在毛细管中循环流动，针尖可分为两个区域：排出区域（即将在下一个液滴中出现）和沉淀区域（毛细管中可能出现的沉淀区域）。如果沉淀区域是空的，且排出区域包含单个细胞，下一个液滴将会分离到样品孔中。
# TMT标记单细胞蛋白组结果
在使用TMT标记方法进行单细胞蛋白组的研究中，定量准确性一直是研究人员关心的重点。文章中通过使用proteoCHIP工作流程，减少反应体积、人工操作和暴露表面积，在carrier 通道降至20X或更少时，每次分析可鉴定1000个左右的蛋白（图3a）。对比使用20X carrier和不使用carrier时，两者的鉴定结果类似（图3a），例如，使用TMTpro时，20X carrier存在时，平均可鉴定1017个蛋白，不使用carrier时平均可鉴定924个蛋白。
文献中提出使用信噪比过滤可提高 TMT标记单细胞蛋白组的定量准确性[2]，图2b展示了TMT10标和TMTpro样品中的报告离子信噪比，例如，TMTpro样品中，20X carrier和不使用carrier时，报告离子信噪比中位数分别为133和255。虽然使用仪器不同，但相比其它TMT流程，该工作流程以及carrier比例的降低可改善报告离子的信噪比。
对比20X carrier，不使用carrier时报告离子信噪比均可提高约50%，尽管使用的carrier比例已经很低了，但很可能会由于carrier产生的报告离子会占用注入时间，以及可能压缩来自单细胞的报告离子导致该现象。因此，虽然使用carrier 有明显的优势，但是作者还是建议尽可能降低carrier的比例或者不使用carrier。
# 两种相似细胞类型的区分
接着文中应用proteoCHIP流程，对来自Hela和HEK的单细胞进行了分析，共11个TMT10标分析，共110个单细胞。使用20X carrier及不使用carrier样品平均每次分析可获得1300个蛋白，总共获得1894 蛋白。且TMT10标所有通道所得的报告离子强度基本一致，表明样品前处理的高重现性（图4）。基于蛋白组信息，可区分这两种相似的细胞类型。
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参考文献
[1] cellenONE® : all in one solution for single cell proteomics using LC MS/MS sample preparation. Cellenion Application Note
[2] Cheung, T. K. et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nat. Methods 1–8 (2020) doi:10.1038/s41592-020-01002-5.
Thermo Fisher Scientific
United States
