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技术专家
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随着单细胞蛋白组学的发展,研究人员开始越来越关注样品前处理流程的自动化实现。今天小编给大家分享一篇预印本上的文章“An automated workflow for label-free and multiplexed single cell proteomics sample preparation at unprecedented sensitivity”,作者是来自维也纳生物中心的 Karl Mechtler 教授。

 

文中建立了名为proteoCHIP的单细胞蛋白组前处理平台,自动化处理部分采用了商业化的cellenONE 系统,可进行单细胞分离,皮升级分液,完成细胞裂解、酶解、TMT标记等所有前处理过程,并可用于直接LC-MS系统的上样。158个两种不同类型的单细胞分析中,可获得接近2000个蛋白鉴定,并很好区分两种不同的细胞类型。该方法可适用于非标记或标记的前处理流程。

 

# 样品前处理 proteoCHIP

 

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 图1 基于proteoCHIP的TMT标记单细胞蛋白组样品前处理流程(点击查看大图)

 

 

ProteoCHIP采用商业化的cellenONE系统,其大小与标准的显微镜载片类似,由两部分组成。单细胞分离和样品前处理在nanowell部分进行,其中包括12个小块可处理12个非标定量单细胞或者12组TMT标记样品,每组最多处理16个单细胞,总共192个单细胞(图1)。样品合并在funnel部分进行,TMT标记后可通过离心进行样品合并,然后直接用于LC-MS进样。

 

# 单细胞分离

 

可能有些人就会好奇了,这套系统是怎么获取单细胞的,图2中给出了详细的解释[1]。系统中使用了压电式分配毛细管,基于光学检测进行单细胞分离。含有细胞的液体在毛细管中循环流动,针尖可分为两个区域:排出区域(即将在下一个液滴中出现)和沉淀区域(毛细管中可能出现的沉淀区域)。如果沉淀区域是空的,且排出区域包含单个细胞,下一个液滴将会分离到样品孔中。

2.png图2 光学检测法获取单细胞(点击查看大图)


# TMT标记单细胞蛋白组结果

 

在使用TMT标记方法进行单细胞蛋白组的研究中,定量准确性一直是研究人员关心的重点。文章中通过使用proteoCHIP工作流程,减少反应体积、人工操作和暴露表面积,在carrier 通道降至20X或更少时,每次分析可鉴定1000个左右的蛋白(图3a)。对比使用20X carrier和不使用carrier时,两者的鉴定结果类似(图3a),例如,使用TMTpro时,20X carrier存在时,平均可鉴定1017个蛋白,不使用carrier时平均可鉴定924个蛋白。

3.png图3 应用proteoCHIP,不同carrier比例时所得的TMT10标和TMTpro的单细胞蛋白组结果(点击查看大图)

 

文献中提出使用信噪比过滤可提高 TMT标记单细胞蛋白组的定量准确性[2],图2b展示了TMT10标和TMTpro样品中的报告离子信噪比,例如,TMTpro样品中,20X carrier和不使用carrier时,报告离子信噪比中位数分别为133和255。虽然使用仪器不同,但相比其它TMT流程,该工作流程以及carrier比例的降低可改善报告离子的信噪比。

 

对比20X carrier,不使用carrier时报告离子信噪比均可提高约50%,尽管使用的carrier比例已经很低了,但很可能会由于carrier产生的报告离子会占用注入时间,以及可能压缩来自单细胞的报告离子导致该现象。因此,虽然使用carrier 有明显的优势,但是作者还是建议尽可能降低carrier的比例或者不使用carrier。

 

# 两种相似细胞类型的区分

 

接着文中应用proteoCHIP流程,对来自Hela和HEK的单细胞进行了分析,共11个TMT10标分析,共110个单细胞。使用20X carrier及不使用carrier样品平均每次分析可获得1300个蛋白,总共获得1894 蛋白。且TMT10标所有通道所得的报告离子强度基本一致,表明样品前处理的高重现性(图4)。基于蛋白组信息,可区分这两种相似的细胞类型。

4.png图4 Hela 和 HEK 单细胞蛋白组比较(点击查看大图)

 

更多细节请识别二维码▶▶

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参考文献

[1] cellenONE® : all in one solution for single cell proteomics using LC MS/MS sample preparation. Cellenion Application Note

[2] Cheung, T. K. et al. Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics. Nat. Methods 1–8 (2020) doi:10.1038/s41592-020-01002-5.

 

@dongdan 

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