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距离上次和大家分享单细胞蛋白组的进展也有一段时间了,该是时候给大家分享一些新的进展了。这边,小编选了两篇新发表在预印本中的单细胞蛋白组学研究,围观下都做了哪些改进推进单细胞蛋白组的不断发展。

 

01 基于TMT的单细胞蛋白组样品前处理流程改进

 

作者使用了嵌套式的nanoPOTS(N2) 芯片,可显著提高蛋白回收率、操作稳定性和流程通量。N2芯片中,进一步降低酶解体系至<30 nL,单个芯片中可处理>240个单细胞。应用该体系进行约100个单细胞(三个不同的细胞系)的分析,可稳定定量约1500个蛋白,蛋白丰度CV 中位数<16.3%,并可展示不同细胞系的功能差别。

 

样品前处理:结合N2芯片与TMT标记

数据采集:Orbitrap Eclipse MS

芯片设计及工作流程:在N2芯片(共243个孔)的每个孔中,嵌套了九个小孔,可加入不同的单细胞样品,外部以亲水性的微环包裹(图1)。通过此,有以下三个优点:

 

 

  1. 可降低样品前处理体系,提高酶切动力学,从而提高流程灵敏度和重现性;
  2. 提高单个芯片中可分析的样品数目;
  3. 且通过液滴合并可消除耗时长的TMT各标记合并过程。

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图1 N2芯片以及单细胞蛋白组样品前处理流程(点击查看大图)

 

N2芯片的蛋白组学定性和定量性能提升

采用稀释后模拟单细胞蛋白水平的肽段,相比上一代的芯片,N2芯片可显著提升蛋白组灵敏度和定量重现性:蛋白鉴定数目提升15%,蛋白强度提升约230%;批次内蛋白CV中位数下降至<9.6%,批次间蛋白CV中位数下降至<6.7%(图2)。

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图2 nanowell和N2芯片在单细胞蛋白水平时的性能对比(点击查看大图)

 

来自三个不同细胞系的108个细胞(12个TMT set)的蛋白组覆盖性能:12次TMT分析中,9个单细胞通道平均每次能鉴定1716个蛋白,7369条肽段;三个细胞系分别可鉴定1735,1690和1725个蛋白。所有108个细胞中共定量2407个蛋白,提高要求至>70%样品中有报告离子信息,可定量1437个蛋白(图3)。N2芯片所得样品中单细胞样品的信噪比中位数为14.4,与建议的阈值15.5[1]很接近,意味着约50%的二级谱图可用于定量,超过前一代芯片所得结果[2-3]

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图3 实际单细胞样品的蛋白组学结果(点击查看大图)

 

后续作者利用所定量的1437个蛋白可以完成3个细胞系的明显区分,并确定特定的差异表达蛋白。更多细节扫描以下二维码查看原文献。

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High-throughput and high-efficiency sample  preparation for single-cell proteomics using a nested nanowell chip

 

02 结合微流控芯片样品前处理及DIA数据采集的单细胞蛋白组分析

 

作者结合了一体化的蛋白组芯片(iProChip)以及DIA的数据采集模式进行单细胞蛋白组分析,其中iProChip中可自动化完成细胞提取/计数/成像/蛋白组前处理。结合DIA的工作流,可在单个哺乳动物细胞三次重复中共鉴定1160个蛋白。作者将整体流程应用于粘连与非粘连恶性细胞分析中,可获得5个数量级的动态范围,1-100个细胞中高度一致的蛋白定量,高重现性以及低缺失值(<16%)。

 

样品前处理:iProChip自动化处理

数据采集:Orbitrap Eclipse MS

芯片设计及工作流程:iProChip含有9个单元,可同时进行蛋白组学前处理,每个单元中均含有细胞捕获/成像/裂解、蛋白酶解、肽段脱盐和收集部分(图4),其中蛋白酶解部件体积约为312nL。随之,作者对iProChip的细胞捕获效率,反应部件的混合效率以及脱盐回收率做了优化,并对DIA方法的采集条件做了优化。

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图4 iProChip的设计及数据采集流程(点击查看大图)

 

DIA方法评估

针对不同的细胞系,作者分别建立了大规模(1μg)和小规模(~10个细胞)的谱图库,分别用于细胞数目较多(>10个细胞)和较少(5个或单个细胞)的情况。

 

作者对DIA定量方法的灵敏度、蛋白组覆盖度和重现性进行了评估。采用iProChip分别处理13-14个 PC-9细胞,传统DDA方法在三次重复间平均鉴定869个蛋白,而directDIA可鉴定1409个蛋白,基于谱图库的DIA进一步提升至1874个蛋白(图5)。重复间CV<20%条件过滤后,DIA可定量1160个蛋白,而DDA只有522个蛋白,且DIA的缺失值更小(DIA16% vs DDA28%)(图5)。传统DDA方法可获得4个数量级的动态范围,DIA可扩展至5个数量级(图5)。结果展示了DIA方法可实现更高的蛋白组覆盖,缺失值更小,重现性更高,动态范围更大的定量。

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图5 采用PC-9细胞对比DIA与DDA方法的蛋白组性能(点击查看大图)

 

单细胞分析结果

接着作者对更少量的单个细胞以及一系列1-100个细胞进行分析,单个PC-9细胞上次重复平均可鉴定976个蛋白,共鉴定1160个蛋白,不同重复间的重现性较高(Pearson相关系数0.88-0.98)(图6)。且在1-100个细胞间,总蛋白丰度在不同的细胞数目间有良好的log线性关系。

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图6 采用iProChip-DIA对少量细胞进行蛋白组分析(点击查看大图)

 

后续作者利用所建立的工作流程对单个白血病细胞进行蛋白组分析,更多细节扫描以下二维码查看原文献。

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Ultra-streamlinedsingle cell proteomics by all-in-one chip anddata-independent-acquisition mass spectrometry
 

这两篇文献都把重点放在了样品前处理,这无疑是单细胞蛋白组研究中十分重要的一环。数据采集均使用了Orbitrap Eclipse仪器,前一篇结合了TMT的方法,后一篇结合了DIA的方法,给单细胞蛋白组学方法提供了新的发展方向和思路

 

参考文献

[1]Cheung, T.K. et al. Defining the carrier proteome limit forsingle-cell proteomics. Nat Methods 18, 76-83 (2021)

[2]Tsai, C.F. et al. An Improved Boosting to Amplify Signal withIsobaric Labeling (iBASIL) Strategy for Precise QuantitativeSingle-cell Proteomics. Mol Cell Proteomics 19, 828-838 (2020)

[3]Dou, M. et al. High-Throughput Single Cell Proteomics Enabled byMultiplex Isobaric Labeling in a Nanodroplet Sample PreparationPlatform. Anal Chem 91, 13119-13127 (2019)

 

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