关键词：
Vanquish Neo UHPLC, nanoLC-MS/MS, Orbitrap Exploris 480, FAIMS Pro Duo
引言
蛋白质组学研究是系统式鉴定、定量蛋白质，并全景式研究蛋白质功能的学科。随着学科的进步，对于自下而上（Bottom-up）蛋白质组学的分析深度的需求不断增加。蛋白质组学的分析深度可显著影响人们对于生理、病理过程的理解，以及影响早期诊断的生物标志物的发现等领域，而随着精准医学等应用方向的研究不断深化，则需要更高灵敏度更高分辨率的分析手段。在蛋白质组学的发展历程中，基于毛细管色谱柱的纳升液相联合高分辨质谱的成功应用，使得蛋白质组学研究以超高的灵敏度、极小的上样量为其特点而著称，可在质谱端获得几千甚至上万蛋白的鉴定深度。这些优异性能也极大的拓宽了蛋白质组学技术在生命科学领域的应用范围。
在反相液相色谱的分析中，为实现对较低丰度多肽的鉴定，通常需要使用更长的色谱柱以提供更高的色谱峰容量，而较长的色谱柱也对于色谱耐受压力提出了更高的要求[1-2]。
本文我们以全新一代可耐压1500 bar的Vanquish Neo UHPLC 液相色谱搭载Orbitrap Exploris 480高分辨质谱仪，测试了不同长度的色谱柱在不同梯度内对Hela细胞裂解液的鉴定能力，同时也考察了全新的FAIMS Pro Duo在此色谱-质谱组合中的鉴定提升能力。
实验方法
1. 样品前处理
Hela细胞，抽提蛋白质、还原烷基化后用FASP方法进行Trypsin酶切[3]。
2. 色谱方法
高效液相色谱：Vanquish Neo UHPLC
色谱柱： EASY-Spray™ PepMap™ Neo 2 µm C18 75 µm X 150mm，货号 ES75150；EASY-Spray™ 2 µm C18 75 µm X 750 mm，货号 ES905；Acclaim™ PepMap™ 100 C18，75 µm X 250 mm，货号164941
色谱梯度时长：24min（总梯度），60min（总梯度），90min（有效梯度），120min（有效梯度），180min（有效梯度）
液相梯度示例：LC gradient_90min，有效梯度90min
3. 质谱方法
质谱仪：Thermo Scienti c Orbitrap Exploris 480
Spray voltage：2.1 kV；Capillary temperature：275 ℃ ；
Full MS：Resolution 60,000@m/z 200；RF lens: 45%; AGC target：300%；Max IT: Auto；Scan range：m/z 375-1200；
ddMS2：Intensity threshold: 1e4; Charge state: 2-5; Dynamic exclusion：60s; AGC target：50%；
Max IT: Auto；Resolution 15,000@m/z 200；Isolation window: 2 Da；Collision energy: 26% HCD；First Mass：m/z 120；TOPN：15；
FAIMS CV：单电压 -43V; 双电压 -43V及 -63V；三电压 - 38V、-53V及-63V
4. 数据分析
数据检索软件：Thermo Proteome Discoverer 2.5，使用INFERYS_Rescoring _SequestHT_Percolator_2stage方式检索；
蛋白序列库：Swiss-prot-Homo sapiens (Human)，updated on 2016-06，20148 entries；PSM，肽段和蛋白FDR均<0.01
结果与讨论
1. 不同长度色谱柱鉴定结果
全新的Vanquish Neo UHPLC 液相色谱可耐受1500bar压力，配合可耐压1500bar的色谱柱，使得在较长色谱柱上也可实现快速的上样及平衡，为日常使用提供了便利。其在不同梯度中所得鉴定如图1所示，相同的500ng Hela肽段上样量时，使用25cm色谱柱，90min梯度可鉴定蛋白约5500个；而使用75cm色谱柱，90min梯度可达到约6000个蛋白的水平。
图1：不同长度色谱柱的蛋白鉴定量
2. 不同色谱梯度鉴定结果
图2：不同长度色谱柱在24min和60min色谱梯度下的蛋白鉴定量
图4：不同长度色谱柱在90min、120min及180min色谱梯度下的蛋白及肽段鉴定量
短梯度高通量蛋白组学分析：日益增长的临床大队列分析需要高通量的蛋白组学性能，因此，我们测试了较短梯度下该系统的性能，结果如图2所示，24min条件下，500ng Hela肽段即可获得约3000个蛋白的鉴定能力，这使得面对大样品量时的短梯度高通量运行成为了可能，在满足鉴定量需求的前提下，显著提高蛋白质组学的日均通量。
深度蛋白组学覆盖：虽然使用不同色谱柱，其绝对鉴定量有差异，但随着液相梯度延长，蛋白鉴定量提升的趋势均一致，这也是蛋白质组学检测中的常规现象[4]；值得注意的是，基于全新Vanquish Neo最高可耐受1500bar压力的特点，极长色谱柱也可兼顾快速上样与平衡，拓宽了质谱鉴定的单针覆盖深度。ES905 75cm色谱柱在180min梯度下，单针可达到6700个蛋白的鉴定深度，同时其多肽鉴定可达7万以上（图3），说明这套高分辨的色谱质谱体系，可较好的应对蛋白质组学的深度覆盖需求。
色谱柱长度的影响：在不同色谱柱维度的横向比较中，我们发现，在较短梯度条件下(24min及60min)，15cm长度色谱柱可获得与25cm长度色谱柱相似的鉴定能力；而在较长梯度下，更长的75cm的色谱柱表现出更优秀的鉴定能力，90min，120min，180min下均显示出优良的鉴定数量，如在180min色谱梯度下可达到6700个蛋白的鉴定量。在不同的色谱梯度时可以选择不同长度的色谱柱以平衡鉴定通量和深度。
3. 使用FAIMS Pro Duo接口在不同色谱柱不同色谱梯度下的鉴定结果
除此之外，我们也使用FAIMS Pro Duo接口对蛋白的鉴定提升能力进行测试，结果如图4所示。在不同长度的色谱柱及不同的色谱梯度条件下，蛋白的鉴定深度均有不同程度的提升。在短梯度24min梯度条件下，FAIMS方法采用单电压模式，15cm及25cm色谱柱均可达到约3700个蛋白的鉴定量；而在60min色谱梯度下，FAIMS方法采用双电压模式，蛋白鉴定量可达到5400个蛋白；在长梯度180min条件下，75cm色谱柱1μg Hela多肽上样，FAIMS方法采用三电压模式可使蛋白鉴定深度进一步提升至约7400个蛋白。以上数据进一步说明
FAIMS Pro Duo接口在不同色谱梯度下的鉴定提升能力，可获得更加优异的数据。
图3：使用FAIMS Pro Duo接口，不同色谱梯度下的蛋白鉴定量
结论
综上所述，基于纳升级流速的LC-MS/MS是蛋白质组学深度覆盖的有力抓手，而赛默飞全新一代Vanquish Neo UHPLC 液相色谱可提供1500 bar的压力上限，可以在实现较为快速上样及平衡的前提下，在更长色谱柱和更长梯度中可获得更高的Bottom-up蛋白质组学的单针覆盖深度。同时，在短梯度测试中的优异表现，也表明了短梯度高通量的方法可达到常规需求的检测深度。全新一代Vanquish Neo UHPLC 液相色谱以其优异的性能、毋庸置疑的稳健性、简便的操作流程使得基于纳升级流速串联高分辨质谱的蛋白质组学更加便捷的使众多用户获益。
参考文献
[1] Lopez-Ferrer, Daniel, et al. "Pushing the limits of bottom-up proteomics with state-of-the-art capillary UHPLC and orbitrap mass spectrometry for reproducible quantitation of proteomes." Thermo Fischer Scientific (2016).
[2] Zheng, Runsheng, et al. "Vanquish Neo UHPLC system sets new performance standards for single-shot nanoLCMS bottom-up proteomics." TN74152 (2021).
[3] Wiśniewski, Jacek R., et al. "Universal sample preparation method for proteome analysis."Nature methods 6.5 (2009): 359-362.
[4] Wang, Xiaoli, et al. "Peak capacity optimization of peptide separations in reversed-phase gradient elution chromatography: fixed columnformat." Analytical chemistry 78.10 (2006): 3406-3416
Thermo Fisher Scientific
United States
