前言
机体的生命活动由功能基因-编码蛋白-代谢调控所支撑，代谢物作为基因调控网络的最下游阶段，在疾病健康、植物学领域、食品营养乃至环境毒理方面都发挥着极大的作用，吸引着越来越多的科学家们尝试从代谢的角度进行多方面多层次的研究。目前，代谢物作为在分子水平上对生物表型动态和敏感的测量手段已被广泛接受，使得代谢组学成为精准医疗的重要组成部分，在疾病生理病理相关过程、生物标志物、机制探索以及新的治疗靶点研究中具有良好的应用前景[1-5]。
然而在常规的代谢组学分析中，通过代谢物丰度的测量的结果不能准确提供有关细胞内代谢率和代谢途径活性的信息[6]。例如，代谢物积累可能来源于上游物质产量的增加，也可能来自于下游物质消耗量的减少。同时应注意的是，生物体内的代谢物来源可能存在多条路径，因此代谢物丰度的变化也可能来源于已知或未知的其他代谢通路。因此，单纯从代谢物丰度变化的显著程度来解释疾病发生发展的过程，存在很大的不确定性。
代谢流量分析通过使用稳定同位素示踪剂进行生物体实验，检测生物样本中的代谢物水平以及稳定同位素标记的状态，从而推断代谢物流经的通路及流量，提供相关代谢物在某一通路的动态变化信息。这项技术已成为近年来的研究热点技术之一，在肿瘤、糖尿病等疾病机制研究中得到广泛的应用。
图1. 代谢物水平与代谢流量的差异[6]（图片选自2018年Cell 杂志）
本文拟通过基于Orbitrap Exploris 系列超高分辨质谱的细胞样品的代谢流分析，包括样品制备、仪器检测、以及数据分析等流程，验证Orbitrap Exploris 系列超高分辨质谱在代谢流分析中的应用潜力，以期为开展代谢流研究的科研人员提供帮助。
图2：代谢流研究分析流程
同位素示踪试剂的选择
目前基于代谢流的研究通常存在2种方向：稳态同位素实验和非稳态同位素实验[8]。在稳态实验过程中，同位素的标记模式独立于代谢物的水平，因此主要适用于确定同位素对于细胞内代谢物的生物合成及代谢途径的相对贡献。稳态标记实验往往需要的时间较长，比如细胞培养种，糖酵解代谢通常需要10分钟，TCA循环通常需要2个小时，而核苷酸代谢则需要24小时才能达到同位素稳态[6]。非稳态实验侧重于同位素到达平衡之前的同位素示踪剂的传播动力学，反应的是代谢物通量的信息。实验过程中，非稳态实验往往需要非常快速的采样来获得标记动态（如糖酵解需要每隔10 秒进行取样；TCA 循环需要在 15、30、60 和 120 分钟等时间点进行取样）；同时流量分析严重依赖细胞内代谢物水平，因此需要对代谢物进行定量分析，并且需要建立数学模型来将代谢物和细胞外或器官间代谢物交换进行拟合[9]。在代谢流研究中，主要涉及的代谢通路包括葡萄糖的代谢（糖酵解、TCA 循环、磷酸戊糖途径）、谷氨酰胺、丝氨酸及脂类代谢等代谢途径。常用的同位素示踪剂包括2H标记的葡萄糖、水；不同位置的13C标记的葡萄糖、谷氨酰胺、丝氨酸等；以及15N标记的谷氨酰胺等
等。此外，还有诸如丙酮酸、乙酸、甘氨酸等多种示踪剂可供选择，研究者需依据不同的研究目的和代谢途径选择合适的示踪剂，更详细的示踪剂及标记途径请参考相关文献 [6-8] 。
图 3.不同标记的葡萄糖 TCA 循环的示例 [7] （图片选自文献7）
表1.常见的同位素标记试剂
仪器检测的需求
质谱技术作为代谢物的检测主要手段，在代谢流分析中应用非常广泛。多项研究表明，仪器的质量分辨率在代谢流研究中起着非常重要的作用。足够高的分辨率和质量精度可以排除背景离子干扰，同时可以区分标记的精细同位素分布和分子中其他元素的天然同位素的干扰，从而在未知代谢物发现和代谢途径方面获得更好的结果。比如棕榈酸M+1的同位素体存在2H和13C两种形式，需要分辨率大于100,000以上才能区分这两种同位素[6] 。
赛默飞应用开发中心采用含有稳定同位素标记的13C6葡萄糖培养的肿瘤细胞代谢流分析中，分别采集3万，6万，12万及24万不同分辨率模式下的数据进行分析，考察分辨率对代谢流同位素分布模式的影响。如图4所示，随着分辨率的提高，苹果酸的M+2的同位素峰逐渐清晰。在实际分辨率低于75000时，18O和13C2的同位素峰存在严重的重叠。因13C2的同位素峰丰度相对较低，在常规的代谢组学分析中即便检测不到，对定性和定量结果的影响较小，因此并没有引起重视。但在代谢流分析中，天然同位素的缺失会引起同位素示踪后的丰度产生较大的偏差，因此对结果的准确性带来不可忽略的影响。当苹果酸实际的分辨率到达14万时，18O和13C2的同位素可以清晰的分离，赛默飞应用开发中心保证了代谢流分析结果的准确性。值得一提的是，在样品分析中，提高分辨率并不会导致苹果酸的响应降低，4针不同分辨率分析的响应偏差约为1.8 %，保证了获得精细同位素分布的同时，灵敏的检测到低响应的代谢物。
图4：超高分辨率在区分苹果酸精细同位素上的重要性
另外一项针对乳腺癌细胞的代谢流研究中，通过对能量代谢途径的检测表明，提高仪器的分辨率，可检测到更多标记状态的代谢物，从而为发现未知代谢途径提供了可能。采用含有稳定同位素标记的13C6葡萄糖和13C5
15 N2谷氨酰胺培养基中培养MDB-MA-231细胞， 分别收集1分钟，10分钟，2小时以及24小时候的样品进行分析，以ADP为例，标记2小时的样品和24小时候的样品的同位素分布基本类似，后续的分析中采用标记24小时的样品进行能量代谢途径检测。
图5：MDB-MA-231细胞不同时间培养能量代谢质谱图
以尿嘧啶核苷酸(UMP)为例，采集不同分辨率模式下样品的数据，随着仪器上的MS分辨率增加，UMP的同位素峰变得更加明确，如下图UMP的M+1~M+6峰所示。以m/z=325为例，M+2的同位素峰存在13C2，15 N2及13C+15 N三种形态，在分辨率低于60000时，只能检测到其中的1~2种形式，且因为分辨率不够导致峰重叠，检测到的精确质量数并不准确。当提高分辨率到120000及以上时，可以清晰的检测到M+2的3种同位素分布模式，同时提供了非常精确的质量数，偏差<1.5ppm。以上结果表明，高分辨率和稳定的质量准确度是准确分别同位素标记代谢物的重要因素，帮助更准确的示踪复杂样品中的同位素分布状态，确认代谢途径，同时为新的代谢途径的发现提供数据支持。
图6：不同分辨率模式下UMP精细同位素分布的重要性
数据分析
依据实验目的的不同，稳定同位素标记实验分为以验证通路为目的的靶标代谢流分析；以及以验证或发现新的通路为目的的非靶标代谢流分析。其中靶标代谢流分析往往需要提前获知目标代谢物，从而获得代谢物的同位素分布情况并对天然同位素进行校正。赛默飞的代谢流方案是基于非靶标的代谢流分析，帮助更全面的示踪样品中的同位素标记状态，确认代谢途径，同时为新的代谢途径的发现提供数据支持。
非靶标代谢流分析的 与常规代谢组学比较一致，涉及色谱峰自动提取，mzCloud或mzVault标准品数据库的鉴定，从而获得样品中所有代谢物的元素组成，经天然同位素校正后获得代谢物的标记的状态（Rel.Exchange及Exchange Rate）。以13C标记的葡萄糖培养的肿瘤细胞代谢流分析为例，原始数据经Compound Discoverer 非靶标代谢流Work ow 流程处理后，分析结果见图7a，软件自动分析每个代谢物被同位素标记的状态。截图显示的柠檬酸、苹果酸及ATP均被标记，而苯丙氨酸、谷胱甘肽未被标记。以柠檬酸为例，经mzCloud标准品数据库镜像匹配，确定为柠檬酸C6H8O7，质量数偏差-0.5ppm，匹配分值为99.2分。软件自动确定元素标记的最大个数为6，列表中给出柠檬酸未标记（M+0）的比例为49%，M+2的标记比例为42%。同时，柱状图可给出每个、以及每组样品柠檬酸标记的状态，折线图可以给出柠檬酸总量的变化，结合模型完成流量分析。
图7a：Compound Discoverer 代谢流分析结果
图7b：Compound Discoverer 代谢流分析流程：mzCloud 鉴定
图7c&d：不同组柠檬酸总量及标记同位素状态
我们采用商品化的大肠杆菌提取物对整个代谢流分析流程进行了验证。分别采用未标记和全标记的E.coli 提取物进行不同比例的混合，标记/未标记混合比例分别为0,10,25,50及100%，采用Orbitrap Exploris 240分析混合之后的样品，并采用Compound Discoverer进行数据分析。结果表明，Compound Discoverer 给出的稳定同位素标记的比例与实际掺入的比例一致，偏差在6%以内。
图8：大肠杆菌提取物代谢流分析流程的验证
代谢流分析的最后一步为代谢途径分析，软件自带378条经过验证的通路，也可搜索KEGG、BioCyc的数据进行代谢网络分析。如以下糖酵解途径中，红色标记的结果是为此样品中检测到的代谢物，并可选择“标记状态”、“标记量”等参数更直观的可视化代谢通路。
图9：代谢途径分析
总结
细胞中的代谢是高度复杂且受基因-蛋白-代谢严密调控的动态变化网络，经过多年的发展，代谢流分析技术已经逐渐成熟，成为生命科学领域研究不可或缺的技术手段之一。赛默飞建立的基于Orbitrap超高分辨质谱技术，以及基于Compound Discoverer 的非靶向代谢流分析，可以帮助研究人员更清晰、全面、准确地获得样品中的代谢水平和稳定同位素标记状态，从而更好地整合、利用所获取的代谢重塑和机制信息，结合基因组学、蛋白组学、代谢组学等应用，将有助于加深我们对于生物学的理解，在肿瘤、代谢性疾病等疾病机制研究
中得到广泛的应用。
参考文献
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仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。
Thermo Fisher Scientific
United States
