关键词:
Exploris 240，非靶标代谢组学，脂质组学，代谢流，AcquireX
前言
代谢组学和脂质组学技术是近年来发展发展迅猛的一门学科，在疾病生理病理相关过程，生物标志物和机制探索中具有良好的应用前景，并逐渐在多个领域得到广泛的应用。如疾病研究、食品营养、环境毒理、植物等与人类健康护理密切相关的领域[1-7]。
代谢组学因其样本的高度复杂性和代谢物的多样性，在研究中遇到诸多的需求和挑战。特别是更高的代谢物组覆盖率，更高的灵敏度、大队列研究中的稳定性和重现性，对仪器分析提出了非常高的要求。赛默飞在今年的美国质谱年会上最新发布了新一代的四极杆-静电场轨道阱质谱Orbitrap Exploris 120和240。该系统进行了全新的设计，进一步拓展了赛默飞超高分辨质谱的产品线，同时为我们带来了很多优越的分析性能和体验。这些性能在应对代谢组学和脂质组学的挑战中，具有多方面的应用价值。
本文通过NIST 1950标准血浆样品，建立Orbitrap Exploris240代谢组学和脂质组学分析方法。以期通过对新产品性能的测试，体现Exploris 240在代谢组学、脂质组学和代谢流分析中的应用潜力和特点。
实验方法
1. 样品信息
• 样本类型：血浆样品，NIST SRM 1950
• 血浆样品置于4℃冰箱解冻后，取50μL，加入200μL-80℃预冷的甲醇，涡旋混匀5分钟。离心10分钟（4℃，14,000g），取200μL上清，吹干，加入50μL 的MeOH/H2O=1:9溶液复溶，取上清进样2μL分析。
2. 色谱方法
超高效液相Vanquish Flex系统进行色谱分离，色谱柱为 Hypersil Gold C18（2.1 mm × 150 mm，1.9 μm）；流动相为0.1％甲酸水（A）和0.1%甲酸甲醇（B）。流速为0.3mL /min，进样体积2uL，柱温40℃，采用梯度洗脱：
表1 梯度洗脱程序
采用AcquireX 智能数据采集模式获得正负离子模式下一级和二级信息。离子源参数如下：喷雾电压 (+/-)：3500V/3200V；离子传输管温度：320℃；鞘气压力40 arb；辅助气压力10 arb；离子源温度：350℃。质谱
扫描参数：扫描范围（Da）：70-1050；Full Mass分辨率：120000，MS/MS分辨率：15000；
3. 实验结果和讨论
3. 1 血浆样本色谱图及重现性
代谢组学研究中，因样本的数量较大，样品的检测往往要持续很长时间。在检测过程中，仪器的稳定性对于获得高质量的数据十分重要。采用优化的色谱和质谱条件，采集血浆样品一级和二级数据。连续3针样品叠加色谱图如下，从图中可以看出，正离子模式和负离子模式下的所有代谢物的保留时间，质量数，以及代谢物的响应强度均保持一致。这些数据将为队列分析提供最佳质量的数据，最小化仪器因素对实验结果的影响。
图1. 正离子和负离子模式下，样品叠加色谱图
3.2 质量数偏差及稳定性考察
精确分子量提供了代谢物鉴定最主要的信息，采集数据的质量精度越高，所推测的元素组成越准确，越有利于研究者了解待鉴定的化合物。Exploris 240传承于Orbitrap 的数据质量及超强稳定性，可长时间维持亚ppm 级的质量准度，而且可保持质谱图中每一个扫描点的质量精度均达到约亚ppm水平。以血浆样品中的色氨酸为例，在整个测试周期内，（总共4天）校正后低1天和第4天的数据表明，一级和二级的质量数偏差均在1ppm以
内。这为随后的特征提取、谱峰匹配与相对定量奠定坚实基础。
图2. MS1和MS2质量数偏差，稳定性
3.3 仪器分辨率
在常规的代谢组学和脂质组学研究中，我们的研究对象往往是血液、细胞、组织等基质非常复杂的样本。在这样一项没有“答案“的研究中，我们设立的标准越高，找到答案的可能性就越大。仪器的分辨率是不可或缺的提高标准的手段之一。Orbitrap Exploris™ 240 的分辨率高达240,000(@200m/z)，不但可以让我们的目标物和”背景“离子分离的更加彻底，同时可以获得每个代谢物准确的精细同位素分布信息。
在实际的样本检测中，我们可以获得与设定的分辨率一致的效果。以甲硫氨酸为例，选择不同的分辨率模式，采集R=15,000,30,000,60,000，120,000和240,000的数据，结果发现，实际检测数据与理论同位素分布一致。进一步对比发现，只有当分辨率大于12万以上时，C、H、N 和S的特征同位素可以显著区分。这一点在代谢流研究中尤其重要，通过精准的同位素分布，确定代谢物的精准流向，有望让我们的科研成果更进一步，更深入准确地了解疾病发生发展的过程。
图3. 不同分辨率模式下甲硫氨酸与24万分辨率下的理论同位素分布
3.4 AcquireX 智能化数据采集模式
代谢物鉴定一直是代谢组学研究的瓶颈之一，目前对代谢物鉴定最行之有效的办法是建立标准品谱图数据库，通过谱图对比、碎片确证的方式，可以对代谢物进行快速准确的鉴定。代谢组学样品因其基质的多样性，以及成分的高度复杂性；对于低丰度的组分，传统的DDA模式很难采集到其二级质谱图进行定性分析。Acquire X智能化数据采集模式可以自动生成排除列表及包含列表，特别适合于复杂样品的深度分析。AcquireX采集数据
过程中，以溶剂作为空白对照，用于自动生成排除列表，排除背景离子；血浆样本用于生成包含列表。采集过程中将自动进行数据处理，实时迭代更新采集方法。如某一离子已经触发了MS/MS碎片，在下一针采集将自动加入到排除列表中，避免数据的冗余，节省出更多时间用于更低丰度离子的MS/MS触发。
图4. AcquireX 智能化数据采集模式流程图
实验结果表明，采用传统DDA模式采集，从单针样品中获得7721个化合物的二级谱图信息；采用AcquireX模式可以获得9512个化合物的二级谱图信息。除此之外，AcquireX 模式下3针样品二级增加的个数和趋势远大于DDA模式。
图5. 传统DDA模式和AcquireX模式二级碎片对比
3. 5 轻度捕获模式
代谢组学和脂质组学样本中，代谢物在质谱传输过程中存在裂解的现象，从而导致：（1）目标代谢物响应降低，影响LOQ；（2）裂解产生的碎片离子触发DDA扫描，影响二级离子的有效性；（3）碎片离子也是一种成分，影响定性和定量的结果。在新发布的Exploris 120/240仪器中，引入了Mild Trapping的轻度捕获模式，以更温和的采集方式，减轻MS1解离水平，提高易碎代谢物的响应强度。结果表明，采用Mild Trapping采集模式，相对于标准模式，亮氨酸、色氨酸等5个化合物的响应强度提高16~47%；同时源内裂解的碎片响应降低14~68%。
图6. Mild Trapping 模式和标准模式下代谢物响应
4. 总结
本文通过血浆样品进行测试，Orbitrap Exploris 240具有一系列适合于代谢组学和脂质组学分析的特点。（1）更高的分辨率和更快的扫描速度，单位时间内获得更多的一级和二级谱图数目，有效实现数据信息最大化；（2）独特的AcquireX 智能化数据采集模式，可以增加二级谱图的数目，增加鉴定的深度和广度；（3）创新性的Mild Trapping采集模式，降低化合物在传输过程中的裂解水平，提高易碎代谢物的响应强度，增强定性定量结果；（4）同时传承于QExactive 系列质谱的数据质量及超强稳定性，正负切换功能，Exploris 240超高分辨质谱将在代谢组学，脂质组学，代谢流，大队列分析等应用中大放异彩。
参考文献
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2. Cader, M. Zaeem et al.FAMIN Is a Multifunctional Purine Enzyme Enabling the Purine Nucleotide Cycle; Cell, Volume 180, Issue 2, 278 - 295.e23
3. Jiao Chen, Iben Sørensen,Xuepeng Sun et al.The Penium margaritaceum Genome: Hallmarks of the Origins of Land Plants; Cell, Vol. 181, Issue 5, p1097–1111.e12
4. Chao, Jiang, Xin Wang,Xiyan Li.et al. Dynamic Human Environmental Exposome Revealed by Longitudinal Personal Monitoring.[J]. Cell, 2018. Cell, Volume 175, Issue 1, 277 - 291.e31
5. Goodman, R.P., Markhard, A.L., Shah, H. et al. Hepatic NADH reductive stress underlies common variation in metabolic traits. Nature 583, 122–126 (2020).
6. Pareek V , Tian H , Winograd N , et al. Metabolomics and mass spectrometry imaging reveal channeled de novo purine synthesis in cells[J]. Science, 2020, 368(6488):283-290.
7. O’Donnell, M.P., Fox, B.W., Chao, P. et al. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensorybehaviour. Nature 583, 415–420 (2020).
仅用于研究目的。 不可用于诊断目的。
Thermo Fisher Scientific
United States
