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在精准医学和大队列组学背景下,对分析深度及数据质量提出了更高的要求。近年来,质谱灵敏度由于电离、传输和检测等硬件及技术的改善而大大提高。除质谱之外,也需一种兼具灵敏度和稳健性的色谱分离工具。

 

相比于常规液相,纳流液质联用仪(nano-flow LC-MS/MS)在更低流速下提高了肽段在电喷雾(ESI)中的离子化效率,拥有卓越的灵敏度,因此成为近20年来蛋白质组学的主流方法,但同时也有耗时长、通量低、重现性差、易过载、难维护等缺点。相较于纳升液相,微流液相色谱质谱串联系统(μLC-MS/MS)具有更高稳定性和更高通量,或将成为蛋白质组学分析的一种可行的替代方法。

 

μLC-MS /MS系统的定性定量性能

 

来自慕尼黑工业大学的Bernhard Kuster教授在2020年的一篇Nature Communication文章中详细介绍了微流液相色谱质谱串联(μLC-MS/MS)系统,并对此系统做了一系列评估和优化[1]。该方法的关键是使用1×150mm商业化反相色谱柱(流速50 μL/min),结合高灵敏度的质谱,不需要专门的设备,即可明显提高定量分析的稳健性、通量以及重现性。1mm色谱柱的横截面积比常用的75μm内径纳升色谱柱大178倍,特别是在分析组织、体液等复杂度高且动态范围大的样品时,可有效消除色谱柱过载以提高分离效率。与1mm内径相匹配使用的更大流速可以获得更窄的色谱峰,而更大流速引起的灵敏度损失可通过加入适量的DMSO补偿。如图1所示,与Nano-LC对比实验发现,在质谱使用28Hz的扫描速度时,μLC-MS/MS仅需5倍的进样量便能获得与nano-LCMS/MS接近的肽段和蛋白鉴定结果。

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图1. μLC -MS /MS系统的鉴定性能(红色代表nano-LC MS/MS的结果, 蓝色代表μLC-MS/MS的结果)(点击查看大图)

 

借助μLC-MS/MS系统在连续40天中测试了1550个细胞、组织及体液样品,每个样品均掺入40条标准肽用于评估保留时间和肽段残留情况。如图2B所示,结果展示了稳定的色谱保留时间(CV<0.3%)和较低的样品残留(<0.2%)。同时良好的色谱重现性也提升了蛋白和肽段定量的重现性(图2C、2D)。

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图2.μLC-MS /MS系统的定量性能(点击查看大图)

 

基于μLC-MS/MS进行多路复用及微量样品分析

 

TMT串联质谱标签策略能够从单次LC-MS/MS分析中同时获得多个样品中蛋白的定性定量信息,凭借其周期短、通量高、缺失值少等优势而被广泛应用于定量蛋白质组学中。

 

结合μLC-MS/MS,16h即可从分级的labelfree样品中检测到>9000个蛋白和>120000条肽段(图3A、3B)。TMT标记定量策略又可将分析通量提升11~16倍,一天内可以对11~16个样品完成深度分析(图3C、3D)。

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图3. μLC-MS /MS进行TMT深度定量(点击查看大图)

 

对复杂度更低的样品而言,μLC-MS/MS表现又如何呢?譬如亲和纯化(AP)样品结果显示,μLC-MS/MS在15min内即可完成一个样品的检测,三次单针重复可以覆盖到已有文献中96%的高可信互做蛋白(图4A)。对于占比不到1%的磷酸化蛋白组来说,12h内鉴定到>30000条磷酸化肽段(图4B),而且可以更可靠地检出更多不同修饰形式的磷酸化肽段异构体(图4C)。

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图4. μLC-MS /MS进行AP-MS及磷酸化样品分析(点击查看大图)

 

稳健的μLC-MS /MS用于临床样本深度分析

 

nanoLC-MS/MS具备很高的灵敏度,但通量和稳健性不佳,也就限制了其在大队列临床分析中的应用潜力。Bernhard Kuster实验室在过去两年用两台Orbitrap质谱分析了38000个不同类型的样本[2],结果表明,μLC-MS/MS这种方法非常可靠。系统稳健性的前提之一是需要稳定的色谱柱,如图5B所示,在不损失性能的前提下可以在同一根色谱柱上分析了>12000个样品。

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图5A\B.μLC-MS/MS系统的稳健性评估,并用于常见临床样本的分析(点击查看大图)

 

除此之外,任何液质系统都要求色谱柱不过载,特别是在分析高动态范围样品时这一问题尤为突出。如图5C所示,1μg血浆样品在纳升液相上会有明显的过载,从而影响峰型及定量准确度,而微流液相可以很好地改善了这一不足。

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图5C.上图为μLC-MS/MS的基峰图,下图为nano LC-MS/MS的基峰图。(点击查看大图)

 

借助μLC-MS/MS系统深入分析血浆、尿液等常见的临床样本,能够在1天内从去高峰度血浆和人的尿液中分别检出2600个和5000个蛋白质(图5D),也充分说明了其在高通量临床应用中的潜力。

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图5D(点击查看大图)

 

μLC-MS /MS用于单针样品分析[3]

 

要获得一个深度挖掘的蛋白组学结果,往往需要预先进行二维分级,但这种方式也耗时耗力并且会引入更多的误差。目前蛋白质组学的一个趋势是通过单针LC-MS/MS获取数据,因为它的工作流简单,比涉及过多样品分级的方案有更好的通量和定量准确性。与此同时,在纳流液相系统上进行单针DDA数据采集(ssDDA)时往往也会受到覆盖度不够的限制。

 

在本篇研究中,在样品量不缺乏的应用中,使用微流色谱系统(1.0mm×150 mm色谱柱,流速50μL/min)结合Q Exactive HF-X质谱分析。首先作者对检测量(图6A~C)及色谱梯度时长(图6D)等进行优化,结果显示在28Hz扫描速度下以2~4h梯度时长检测50μg肽段可以获得很高的蛋白质组覆盖深度。加之采用Prosit深度学习机制对肽段二级谱图进行预测,也可以获得更高的蛋白肽段鉴定数目(图6E、6F)

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图6A~F. 优化的μLC-MS /MS ssDDA方法用于单针样品分析(点击查看大图)

 

利用μLC-MS/MS ssDDA的方式,3小时的单针检测,分别从50μg拟南芥根、小鼠胸腺、人乳腺癌细胞中鉴定出约9000个、7500个和7300个蛋白(图6G)。iBAQ方法的定量结果动态范围跨越5个数量级(图6H),重复性分析的变异系数中位值<20%(图6I)。μLC-MS/MSssDDA有望进一步结合FAIMS及DIA采集模式,获得更佳的结果,成为一种适合于大规模蛋白质组的分析方法。

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图6G~I. 优化的μLC-MS /MS ssDDA方法用于单针样品分析(点击查看大图)

 

#本文总结#

 

μLC-MS/MS具有更高稳定性和更高通量等优势,可大大降低质谱数据采集过程的偏差,提升队列数据分析的整体质量,在生命科学以及大队列临床研究中极具应用潜力。


参考文献:

[1].Yangyang Bian , et al., Robust, reproducible and quantitativeanalysis of thousands of proteomes by micro-flow LC–MS/MS. Nat.Commun., 2020, 11:157.

[2].Yangyang Bian, et al., Robust Microflow LC-MS/MS for ProteomeAnalysis: 38 000 Runs and Counting. Anal. Chem. 2021, 93, 3686−3690.

[3].Yangyang Bian , et al., Identification of 7000-9000 Proteins fromCell Lines and Tissues by Single-Shot Microflow LC-MS/MS. Anal. Chem,2021,93, 8687−8692.

 

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